许大兵， 孙余婕， 沈佐君
（安徽医科大学附属省立医院 安徽省临床检验中心，安徽 合肥 230001）
摘要：目的 通过分析慢性粒细胞白血病（CML）患者转化生长因子-β1（TGF-β1）mRNA与bcr/ablP210融合基因转录本（简称bcr/ablP210）的表达水平，探讨两者在CML发病过程中可能的作用。方法 采用实时荧光定量聚合酶链反应（PCR）检测73例CML患者外周血和骨髓中TGF-β1 mRNA及bcr/ablP210的表达水平，以22名健康体检者作为正常对照组。TGF-β1 mRNA与bcr/ablP210的相关性采用Pearson相关分析。结果 CML患者骨髓和外周血样本中TGF-β1 mRNA、bcr/ablP210的表达水平差异无统计学意义（P＞0.05）。正常对照组外周血中TGF-β1 mRNA的表达水平明显高于CML患者骨髓中TGF-β1 mRNA的表达水平（P＜0.05），正常对照组TGF-β1 mRNA的表达水平是CML组的11.39倍。相关性分析显示CML患者TGF-β1 mRNA与bcr/ablP210呈正相关（r=0.53，P＜0.01）。结论 骨髓TGF-β1 mRNA有可能作为一种新的CML诊疗指标。
关键词：转化生长因子-β1；bcr/ablP210；融合基因；转录本
白血病患者细胞因子存在调控异常，因此白血病细胞因子水平的改变是近些年临床研究的热点之一。转化生长因子-β1（transforming growth factor-beta 1，TGF-β1）不仅是重要的造血调节因子，对造血细胞的存活、增生、分化有极其重要的影响，而且也是重要的肿瘤抑制因子。目前，对急性白血病中TGF-β1的研究较多，但对慢性粒细胞白血病（chronic myelogenous leukemia，CML）中TGF-β1的相关研究甚少。此外，融合基因与白血病的发生、发展密切相关，是白血病重要的诊断指标之一。监测融合基因的转录水平及动态变化可诊断白血病并预测复发，是判断白血病预后的可靠指标之一［1］。到目前为止，TGF-β1对CML的早期诊断是否有价值，TGF-β1 mRNA与CML bcr/ablP210融合基因转录本（简称bcr/ablP210）之间是否也存在某种关系不得而知。为此，我们检测了CML患者骨髓TGF-β1 mRNA和bcr/ablP210的表达，探讨它们之间的相关性及在CML发展过程中的意义。
一、研究对象
选择2009年6月至2010年10月及2016年1至5月安徽医科大学附属省立医院门诊和住院的CML患者73例，其中男35例、女38例，年龄14～70岁。其中2009年6月至2010年10月CML患者骨髓样本46份，2016年1月至5月CML患者骨髓和全血样本各27份。所有患者均经临床、血常规、骨髓象、免疫分型及染色体检查确诊。CML诊断标准参照《血液病诊断及疗效标准》［2］。以同期安徽医科大学附属省立医院健康体检者22名作为正常对照组，其中男12名、女10名，年龄30～62岁，血常规均正常、未有血液及其他系统恶性肿瘤。
二、样本采集
在无菌条件下抽取CML患者骨髓2 mL、空腹静脉血2 mL；正常对照组抽取空腹静脉血2 mL。所有样本均采用乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）抗凝。样本采集后采用淋巴细胞分离液分离有核细胞，加入1 mL Trizol试剂抽提总RNA，置-70 ℃保存，统一检测。
三、试剂与仪器
Trizol试剂盒购自美国Invitrogen公司。逆转录试剂盒和实时荧光定量聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）试剂均购自日本TaKaRa公司。ABI 7300型实时荧光定量PCR仪（美国ABI公司）。TGF-β1 mRNA、bcr/ablP210及内参照甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）引物由上海生工生物公司合成，见表1。
表1 TGF-β1 mRNA、bcr/ablP210及内参照GAPDH引物序列
引物名称 引物序列（5'～3'） 长度（bp） 基因库序列号上游 下游TGF-β1 mRNATCCTGGCGATACCTCAGCAACC CGCTAAGGCGAAAGCCCTCAAT 131 NC_000019.10、NC 018930.2 bcr/ablP210 AGCATTCCGCTGACCATCA TCCAACGAGCGGCTTCAC 169 M15025.1 GAPDH AGAAGGCTGGGGCTCATTTG AGGGGCCATCCATCTTC 285 NM_002046.5
四、方法
1. 总RNA提取 采用淋巴细胞分离液分离EDTA抗凝的骨髓和全血样本中的有核细胞，加入1 mL Trizol试剂抽提总RNA，采用分光光度计检测吸光度（A）值验证RNA纯度。当A260 nm/A280 nm比值＞1.8时方可用于实时荧光定量PCR检测。
2. cDNA合成和扩增 取总RNA 5 μL，按逆转录试剂盒说明书合成cDNA。PCR扩增条件：总体积25 μL，5×PCR缓冲液5.0 μL，25 mmol/L MgCl22.5 μL，10 mmol/L dNTP 0.2 μL，上、下游引物各0.2 μL，5 U/μL Taq酶0.2 μL，SYBR Green Ⅰ 荧光染料1.5 μL，cDNA模板3 μL，剩余体积用蒸馏水补足。PCR扩增循环参数：95 ℃5 min变性，94 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，共40个循环。
3. 数据处理 逆转录的cDNA用Tris-EDTA缓冲液稀释成10、1、0.1、0.01 ng/μL（相当于总RNA）作为标准品，分别进行TGF-β1 mRNA、bcr/ablP210及GAPDH的实时定量扩增，制作各自的标准曲线。得出曲线斜率，根据扩增效率公式（E=10-1/slope-1）计算得出TGF-β1 mRNA、bcr/ablP210及GAPDH的扩增效率。当目的基因和内参照基因扩增效率相似时，实验数据（即循环数）直接采用2-ΔΔCt进行处理［3］，计算各样本Ct值和ΔCt值［ΔCt=Ct（TGF-β1或bcr/ablP210）-Ct（GAPDH）］，计算2-ΔΔCt（ΔΔCt=ΔCtCML组-ΔCt正常对照组），其数值用于表示CML组相对于正常对照组的倍数。
五、统计学方法
采用SPSS 17.0软件进行统计分析。数据呈正态分布，采用
一、TGF-β1 mRNA、bcr/ablP210及GAPDH的扩增
TGF-β1 mRNA、bcr/ablP210及GAPDH的扩增曲线形态良好，标准曲线斜率分别为3.412、3.422、3.456，扩增效率相近，适用于ΔΔCt法对TGF-β1 mRNA、bcr/ablP210的相对定量。熔解曲线显示各基因均有单一熔解峰，阴性对照无非特异性峰。
二、CML患者骨髓和同期外周血中TGF-β1 mRNA和bcr/ablP210表达的比较
配对t检验结果显示同一患者的骨髓和外周血中TGF-β1 mRNA、bcr/ablP210的表达水平差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。
表2 CML患者骨髓和外周血中TGF-β1 mRNA、bcr/ablP210的表达 （
样本例数 TGF-β1 mRNA GAPDH TGF-β1 mRNA/ GAPDH比值 bcr/ablP210 bcr/ablP210/GAPDH比值骨髓 27 28.88±3.73 23.75±3.07 1.22±0.13 31.57±3.84 1.34±0.25全血 27 26.77±3.30 23.33±2.35 1.20±0.12 30.69±3.95 1.43±0.29 t值 1.980 0.880 0.570 1.810 1.540 P值 0.058 0.390 0.580 0.080 0.130
三、CML组和正常对照组TGF-β1 mRNA的表达情况
正常对照组外周血中TGF-β1 mRNA的表达水平明显高于CML组骨髓TGF-β1 mRNA的表达水平（P＜0.05）。2-ΔΔCt=2（5.23-1.72）=11.39，即正常对照组TGF-β1 mRNA的表达水平是CML组的11.39倍。见表3。
表3 CML组和正常对照组TGF-β1 mRNA的表达（
注：与正常对照组比较，*P＜0.05
组别 TGF-β1 mRNA GAPDH ΔCt值CML组 27.80±3.69* 22.57±3.15 5.23正常对照组 24.43±1.58 22.71±1.51 1.72
三、CML患者骨髓TGF-β1 mRNA、bcr/ ablP210表达的相关性
CML患者GAPDH（Ct值）为22.57±3.15，骨髓 TGF-β1 mRNA（Ct值）、TGF-β1 mRNA/ GAPDH比值、bcr/ablP210（Ct值）及bcr/ablP210/ GAPDH比值分别为27.80±3.69、1.24±0.16、31.88±5.55、1.44±0.33。相关性分析显示CML患者TGF-β1 mRNA与bcr/ablP210呈正相关（r=0.53，P＜0.01）。见图1。
图1 CML患者TGF-β1 mRNA与bcr/ablP210的相关性分析
CML是一种源于骨髓干细胞的恶性增殖疾病，主要影响血液及骨髓，是临床上较为多见的白血病类型之一［4］。CML的特点是产生大量的不成熟白细胞，这些白细胞在骨髓内聚集，抑制骨髓的正常造血功能；并且能通过血液在全身扩散，导致患者出现贫血、易出血、感染及器官浸润等。90%以上的CML患者有Ph染色体，在t（9；22）（q34；q11）发生基因重排，形成2个融合基因，分别为Ph染色体上的BCR-ABL融合基因和位于9q+上的ABL-BCR融合基因。P210有酪氨酸激酶活性，通过改变关键的调节蛋白磷酸化状况来影响多种信号传导途径，引起细胞周期紊乱、增殖失控或凋亡受阻，从而导致白血病的发生［5］。bcr/abl的不同转录本可能与CML的进程、急性变、疗效和预后有一定关系［6］。因此，探索新的生物学标志物，为CML治疗提供新的诊疗靶点成为目前研究的重点。
TGF-β1作为多效细胞因子，对间充质起源的细胞超刺激作用可抑制上皮或神经外胚层来源的细胞。TGF-β1对白血病细胞有诱导分化的作用，可明显抑制血细胞增殖。TGF-β1通过下调细胞周期素A抑制肿瘤细胞的生长［7-8］。另外，有研究证实TGF-β1在Fas诱导的细胞凋亡过程中起重要的调节作用。TGF-β1通过下调B淋巴细胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，bcl-2）基因、C-myc基因诱导白血病细胞凋亡。由于TGF-β1在CML患者骨髓中含量较低，难以有效诱导白血病细胞凋亡及分化，加速了病情的恶化［9］。本研究结果也证实了这一点。本研究结果显示CML患者TGF-β1 mRNA表达水平明显低于正常对照组（P＜0.05），正常对照组外周血中TGF-β1 mRNA的表达量是CML患者骨髓的11.39倍。由此提示TGF-β1对CML患者病变细胞的抑制作用减弱，使其得以增殖。
穆会君等［10］的研究结果显示BCR-ABL融合基因的高表达及转录因子FoxO3的低表达可能与CML不同阶段的病理过程相关。那么TGF-β1 mRNA与bcr/ablP210是否有关联？本研究结果显示CML患者骨髓TGF-β1 mRNA表达水平明显降低，TGF-β1 mRNA与bcr/ablP210呈正相关（r=0.53，P＜0.01）。因此，BCR-ABL融合基因可能通过激活磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/雷帕霉素靶蛋白通路，对CML细胞产生促增殖和抗凋亡效应，而TGF-β1可抑制蛋白激酶B的活性、激活转录因子FoxO，从而促进CML患者的干细胞趋于静止［5］。由此可见，TGF-β1可能参与了CML的发生、发展过程。TGF-β1可成为CML诊断和疗效观察的指标之一。
本研究中亦有不足之处：CML组检测的样本为骨髓，因难以取得正常人骨髓，所以正常对照组的样本为全血。虽然补充了27例CML患者的骨髓和外周血样本，并得到与文献报道［11］相同的结论（CML患者同期的骨髓和外周血TGF-β1 与bcr/ablP210表达水平无明显差异）。但我们也意识到，对于同一例患者，若将骨髓与外周血样本交叉进行检测，会影响检测结果的统一性，对疗效判断不利。而检测外周血样本可更简便地了解患者体内情况及其变化趋势。关于这方面的研究将会在随后的实验中进一步补充。
参考文献
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Relationship between TGF-β1 mRNA and bcr/ablP210fusion gene transcription expression levels in CML patients
XU Dabing，SUN Yujie，SHEN Zuojun.
（Anhui Provincial Hospital，Anhui Medical University/Anhui Provincial Center for Clinical Laboratories，Hefei 230001，Anhui，China）
Abstract：Objective To investigate the possible pathogenesis of chronic myelogenous leukemia（CML）by analyzing the expression levels of transforming growth factor-beta 1（TGF-β1） mRNA and bcr/ablP210fusion gene transcription in patients with CML. Methods Real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction （PCR） was used to determine the expression levels of TGF-β1 mRNA and bcr/ablP210in peripheral blood and bone marrow of 73 patients with CML. A total of 22 healthy subjects were enrolled as healthy control group. Pearson correlation analysis was used to analyze the correlation of TGF-β1 mRNA and bcr/ablP210. Results The expression levels of TGF-β1 mRNA and bcr/ablP210in peripheral blood and bone marrow of patients with CML had no statistical significance（P＞0.05）. The expression levels of TGF-β1 mRNA in healthy control group were higher for 11.39 times than those in CML group（P＜0.05）. The expression levels of TGF-β1 mRNA and bcr/ablP210had a positive correlation in CML group（r=0.53，P＜0.01）. Conclusions TGF-β1 mRNA in bone marrow may be a new indicator for the diagnosis and treatment of CML.
Key words：Transforming growth factor-beta 1；bcr/ablP210；Fusion gene；Transcription
（收稿日期：2016-03-07）
（本文编辑：龚晓霖）
基金项目：国家自然科学基金项目（30672011）；安徽省卫生厅医学课题（13cz026）
作者简介：许大兵，男，1980年生，学士，主管技师，主要从事临床检验工作。
通讯作者：沈佐君，联系电话：0551-62283847。
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