陈 斌 ，杨银梅，钟志敏，雷秀霞，刘大渔，徐邦牢
（广州医科大学附属广州市第一人民医院检验科，广东 广州 510180）
摘要：目的 建立一种实时荧光环介导等温扩增（LAMP）方法快速检测新德里金属β-内酰胺酶1 （NDM-1）阳性细菌。方法 根据NDM-1 基因序列设计4套引物并进行优化，对LAMP反应中的荧光染料SYTO-9浓度进行优化，同时考察该方法的检出限和特异性。利用本方法检测72例临床分离的多重耐药鲍曼不动杆菌。 结果 本研究建立的实时荧光LAMP方法，其荧光染料SYTO-9的最佳浓度为4 μmol/L；63 ℃恒温扩增35 min可检出101拷贝/μL的标准阳性模板；特异性较好；对72例临床分离的多重耐药鲍曼不动杆菌检出的阳性率为16.7%（12/72），12株NDM-1阳性细菌经测序验证，准确率为100%。结论 本研究建立的检测NDM-1阳性细菌的实时荧光LAMP方法具有快速、操作简便、特异性好、敏感性高、准确、可靠等优点，可以直观、实时地观察反应的进行情况，适合临床NDM-1阳性细菌的快速检测。
关键词：实时荧光环介导等温扩增；新德里金属β-内酰胺酶1细菌；快速检测
“超级细菌”是一类能产生新德里金属β-内酰胺酶1（New Delhi metallo-beta-lactamase-1，NDM-1）的细菌。NDM-1阳性细菌对所有β-内酰胺酶类（包括碳青霉烯类）药物耐药，仅对替加环素、黏菌素等个别抗菌药物敏感，且可借助质粒实现菌种之间的水平传播［1-3］。NDM-1阳性细菌的出现，表明细菌耐药性已成为一个日益严重的全球性公共卫生问题。
目前，临床实验室针对NDM-1阳性细菌的检测方法主要包括筛选试验、表型确认试验及基因确证试验［4］。前2种方法检测时间长，干扰因素较多，易出现假阳性或假阴性结果。基因确认试验是通过NDM-1基因确认超级细菌，适合于快速诊断。聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）是目前病原基因检测最常用的技术［5］，但其需要精确的温度控制仪器。近年来发展的环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）方法，因其快速、高效、特异、灵敏和经济等优点，已经应用于临床病原菌、寄生虫、病毒、疾病和转基因产品检测等领域［6-8］。本研究以实时荧光PCR仪为检测平台，开发出一种实时荧光LAMP方法，用于临床NDM-1阳性细菌的检测。
一、菌株来源和DNA模板提取
收集广州医科大学附属广州市第一人民医院2012年1月至2014年12月临床分离的鲍曼不动杆菌共72株，均对碳青霉烯类抗菌药物（亚胺培南、美罗培南）耐药。全部菌株用VITEK 2 Compact分析仪及配套的鉴定卡和药物敏感性卡（法国生物梅里埃公司）进行菌种鉴定及体外药物敏感性分析。DNM-1阳性菌株为1株鲍曼不动杆菌，其对亚胺培南的最低抑菌浓度（minimal inhibitory concentration，MIC）≥64 μg/mL，其已经过Hodge试验、乙二胺四乙酸协同试验和基因测序的验证［9］。采用德国QIAGEN 公司QIAamp DNA Mini Kit提取细菌基因组DNA，具体步骤按照试剂盒的说明书进行，提取的基因组DNA 在-20 ℃低温冰箱保存备用。
二、仪器与试剂
DNA Polymerase、DL2000 DNA marker由大连宝生物有限公司生产；Bst酶由美国NEB 公司生产；LAMP恒温扩增试剂盒由广州迪澳生物科技有限公司生产；荧光染料SYTO-9由Life Technologies公司生产；MyCycler PCR仪由美国Bio-rad公司生产；LightCycler 480 实时荧光定量PCR仪由Roche公司生产；PCR产物电泳分析使用美国Bio-rad公司的电泳仪；凝胶成像系统由英国UVI公司生产；冷冻离心机Microfuge 22R由美国Beckman Coulter公司生产；Ultrospec 2100 pro紫外分光光度计由美国GE公司生产。
根据NCBI GenBank 数据库查询NDM-1序列（FN396876），采用Primer Explorer V4软件设计4套引物，见表1。各反应体系中分别加入第1、2、3、4套引物（外部引物为B、F，内部引物为BIP、FIP）及其相对应的环状引物（BLP、FLP）。所有引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
表1 NDM-1的LAMP引物序列
引物 名称 序列（5'～3'）1F3 上游外部引物GGTTTGGCGATCTGGTTT 1B3 下游外部引物CCATCTTGTCCTGATGCG 1FIP 上游内部引物ACCGTTGGAAGCGACTGCGAATGTCTGGCAGCACAC 1BIP 下游内部引物CGTGCTGGTGGTCGATACCATCTCCTGCTTGATCCAGT 1LoopF 上游环状引物CCGGCATGTCGAGATAGG 1LoopB 下游环状引物CTGGACCGATGACCAGAC 2F3 上游外部引物ATGGAATTGCCCAATATTATGC 2B3 下游外部引物TGACGATCAAACCGTTGG 2FIP 上游内部引物GTCGCCAGTTTCCATTTGCTGTTAGCCGCTGCATTGATG 2BIP 下游内部引物AACGGTTTGGCGATCTGGTTTCGAGATAGGAAGTGTGCT 2LoopF 上游环状引物AATCGTCGGGCGGATTTC 2LoopB 下游环状引物CTCGCACCGAATGTCTGG 3F3 上游外部引物AACGGTTTGATCGTCAGG 3B3 下游外部引物CGAAAGTCAGGCTGTGTT 3FIP 上游内部引物GTCCTGATGCGCGTGAGTCCTCAACTGGATCAAGCAG 3BIP 下游内部引物AAGATGGGCGGTATGGACGCTGGTTCGACAACGCATT 3LoopF 上游环状引物GACCGGCAGGTTGATCTC 3LoopB 下游环状引物GCGGGGATTGCGACTTAT 4F3 上游外部引物GCATAAGTCGCAATCCCCG 4B3 下游外部引物GGTTTGATCGTCAGGGATGG 4FIP 上游内部引物CTGGCGGTGGTGACTCACGTTTTGCATGCAGCGCGTCCA 4BIP 下游内部引物CGCGACCGGCAGGTTGATCTTTTGGTCGATACCGCCTGGAC 4LoopF 上游环状引物GCATCAGGACAAGATGGGC 4LoopB 下游环状引物TCCAGTTGAGGATCTGGGC NDM-1F上游引物 CACCTCATGTTTGAATTCGCC NDM-1R下游引物 CTCTGTCACATCGAAATCGC
三、方法
1. LAMP反应与产物检测 LAMP方法扩增NDM-1基因片段，反应体系为：Bst酶 8 U，20 mmol/L Tris-HCl（pH 值8.8），10 mmol/L KCl， 10 mmol/L （NH4）2SO4，0.1% Tween 20，0.8 mol/L Betaine，8 mmol/L MgSO4，4 μmol/L SYTO-9，1.4 mmol/L dNTP，1.6 pmol/L FIP/BIP，0.2 pmol/L F3/B3和0.8 pmol/L LoopF/ LoopB。反应条件为63 ℃ 1 h。每次检测均同时检测阳性标准模板和阴性对照样本，于LightCycler 480实时荧光定量PCR仪进行实时检测，每5秒钟检测1次荧光强度。
2. 荧光染料SYTO-9浓度优化 在LAMP反应体系（25 μL）中，在其他反应试剂相同且浓度一致的条件下，分别加入一系列浓度（2、4、6 和8 μmol/L）的荧光染料SYTO-9，每次检测均同时扩增阳性标准模板和阴性对照样本，根据监测扩增荧光信号考察最佳的染料浓度，本试验重复3次。
3. 考察LAMP方法的检出限和特异性 为评价LAMP方法检测NDM-1阳性细菌的检出限，使用广州医科大学附属广州市第一人民医院微生物实验室分离出的1株NDM-1阳性菌株，PCR扩增NDM-1基因，PCR产物经凝胶电泳分析并纯化送大连宝生物有限公司进行基因测序并行T-A克隆，载体为pMD18-T Vector，获得克隆构建的质粒经紫外分光光度计测定浓度，并稀释为105、104、103、102、101和100拷贝/μL浓度梯度，以此作为阳性标准模板进行扩增检测，本试验重复3次。
为评价本方法检测NDM-1阳性细菌的特异性，使用4株质控细菌作为对照菌株，分别为大肠埃希菌（ATCC 25922）、铜绿假单胞菌（ATCC 27853）、金黄色葡萄球菌（ATCC 25923）、肺炎克雷伯菌（ATCC 700603），同时对NDM-1阳性标准模板和NDM-1阳性鲍曼不动杆菌进行实时荧光LAMP扩增检测，本试验重复3次。
4. PCR与测序 PCR的反应体系为50 μL，其中TaKaRa Ex Taq（5 U/μL） 0.25 μL，10 ×PCR Buffer 5 μL，dNTP Mixture（各2.5 mmol/L）4 μL，上游和下游引物（10 μmol/L）各1.0 μL，DNA模板（＜500 ng）4 μL，加入灭菌双蒸水至50 μL。反应条件：94 ℃预变性5 min，94 ℃ 变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循环35次，最后72 ℃延伸10 min。PCR产物片段为984 bp，扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳分析并送上海生工生物工程技术服务有限公司测序，测序结果与NCBI （ http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）利用Blast功能进行基因序列比对。
一、引物的优化
使用经测序验证的阳性样本、阳性标准模板和阴性对照作为检测对象考察引物的特异性，结果见图1。比较图中扩增曲线、扩增时间和扩增效率，因第1、2、4套引物对应的扩增曲线均出现假阳性，故本研究采用第3套引物作为NDM-1扩增的LAMP引物。
二、SYTO-9荧光染料浓度的优化
当SYTO-9浓度为2 μmol/L时，不能标识和区分阳性标准模板和阴性对照样本；而当浓度为4、6和8 μmol/L时，阳性标准模板和阴性对照样本均能区别，且扩增效果较好。考虑到染料成本和高浓度的荧光染料可能对LAMP反应产生抑制等影响因素，采用4 μmol/L的SYTO-9作为后续的试验染料标记浓度。见图2。
三、实时荧光LAMP方法检测NDM-1阳性细菌的检测限
当反应时间约为15 min时，阳性标准模板均出现明显的峰值，而模板101拷贝/μL于35 min时才出现明显峰值；阳性标准模板100拷贝/μL扩增曲线较为平直，无抬高趋势。这说明本研究建立的实时荧光LAMP方法最低检测到的拷贝数为101拷贝/μL。见图3。
四、实时荧光LAMP方法检测NDM-1阳性细菌的特异性
NDM-1阳性标准模板和NDM-1阳性鲍曼不动杆菌扩增曲线分别于15和25 min出现峰值，为阳性扩增信号；对照菌株扩增曲线均为平直直线，无峰值，结果均为阴性。这说明本研究建立的实时荧光LAMP方法只对NDM-1阳性细菌基因组发生扩增反应，对其他4种细菌全部为阴性反应，说明本方法检测NDM-1具有较好的特异性。见图4。
图1 NDM-1 的LAMP引物优化
注：（a）、（b）、（c）和（d）分别为1、2、3、4套引物的实时LAMP反应荧光信号；各图中1为阳性标准模板，2为NDM-1阳性菌株，3为阴性对照样本
图2 LAMP反应SYTO-9染料浓度优化
注：（a）、（b）、（c）和（d）分别为SYTO-9染料2、4、6、8 μmol/L扩增曲线；各图中P为阳性标准模板，N为阴性对照样本
图3 实时荧光LAMP方法检测NDM-1阳性细菌的检测限
注：N为阴性对照菌，105～100为不同拷贝数的NDM-1阳性标准模板
图4 实时荧光LAMP方法检测NDM-1阳性细菌的特异性
注：P1为NDM-1阳性标准模板，P2为NDM-1阳性鲍曼不动杆菌，N1为大肠埃希菌（ATCC 25922），N2为铜绿假单胞菌（ATCC 27853），N3为金黄色葡萄球菌（ATCC 25923），N4为肺炎克雷伯菌（ATCC 700603）
五、临床样本的检测
临床分离的72株鲍曼不动杆菌，经VITEK 2 Compact分析仪的菌种鉴定及体外药物敏感性分析，结果均对碳青霉烯类抗菌药物（亚胺培南、美罗培南）耐药。实时荧光LAMP方法的检出阳性率为16.7%（12/72）。实时荧光LAMP方法检测为NDM-1阳性的12株样本测序后与NCBI （http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）利用Blast功能进行基因序列比对，结果均与已报道的NDM-1序列［10］相符合。
近年来发展的LAMP方法针对靶基因上的6个区域设计3对引物，利用链置换型DNA聚合酶能够在恒温条件（60～65 ℃）下进行扩增反应的特性，可在15～60 min内实现109～1010倍扩增，扩增产量较PCR提高1个数量级， 而且对仪器的温控性能要求较低［11-15］。目前，LAMP反应产物的检测方法存在以下问题：（1）用琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，需开盖检测，容易造成污染；（2）在反应体系中加入染料直接用肉眼观察颜色的变化，在颜色差异较少时肉眼难以判断；（3）利用浊度仪观察扩增产物混浊度，该方法需在LAMP之后将产物放置于浊度仪检测，不能将扩增与检测集成在一起［7-8］。
本研究建立的实时荧光LAMP检测NDM-1阳性细菌的方法具有以下优势：（1）敏感性高、特异性好。本方法检测NDM-1阳性细菌最低敏感性为101拷贝/μL，对72例临床分离的鲍曼不动杆菌检出12例阳性，与测序结果相符，对照菌株均无非特异性扩增。（2）试剂成本较低。目前采用的荧光染料SYTO-9比合成荧光探针价格低，而且SYTO-9较常用的荧光染料SYBR Green I不易出现非特异性扩增，高浓度不易抑制LAMP反应。（3）操作简单、快速。本研究能够实时监测扩增信号，简化产物分析过程，无开盖分析的污染风险，检测时间比PCR缩短30～60 min。目前，许多临床分子诊断实验室已有实时荧光定量PCR仪等设备，本方法容易在临床推广。另外，德国QIAGEN公司研制的ESE-Quant tube scanner集成了恒温扩增和荧光信号采集，该设备小型、便携，但每次仅能检测8个样本，更适合于床旁快速检测。
综上所述，本研究建立的实时荧光LAMP快速检测NDM-1阳性细菌方法具有快速、简单、成本较低等优点，能够满足临床检测的需要，适合在临床推广。
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Establishment and application of real-time fluorescence LAMP for the detection of NDM-1-positive bacteria
CHEN Bin，YANG Yinmei，ZHONG Zhimin，LEI Xiuxia，LIU Dayu，XU Banglao.
（Department of Clinical Laboratory，Guangzhou First People's Hospital，Guangzhou Medical University，Guangzhou 510180，Guangdong，China）
Abstract：Objective To establish a real-time fluorescence loop-mediated isothermal amplification（LAMP）for the detection of New Delhi metallo-beta-lactamase-1（NDM-1）-positive bacteria. Methods According to the sequence of NDM-1 gene，4 primers and fluorescent dye concentration of SYTO-9 were designed and optimized，and the limit of detection and specificity were also evaluated. A total of 72 isolates of multidrug-resistant Acinetobacter baumannii were detected. Results The optimal fluorescent dye concentration of the established real-time fluorescence LAMP was 4 μmol/L. The limit of detection was 101copies/μL for 35 min at 63 ℃. The specificity was good. A total of 72 isolates of multidrug-resistant Acinetobacter baumannii were detected，and the positive rate was 16.7% （12/72）. The 12 isolates were further confirmed by sequencing，and the accuracy was 100%. Conclusions The established real-time fluorescence LAMP for the detection of NDM-1-positive bacteria is rapid，simple，specific，sensitive，accurate and reliable，and it could be used for the routine detection of NDM-1-positive bacteria.
Key words：Real-time fluorescence loop-mediated isothermal amplification；New Delhi metallo-betalactamase-1 bacteria；Rapid detection
（收稿日期：2015-11-24）
（本文编辑：姜 敏）
基金项目：国家自然科学基金项目（81201163）；广东省医学科研基金项目（B2014341）；广东省自然科学基金项目（2014A030313677）
作者简介：陈 斌，男，1983年生，主管技师，主要从事临床分子诊断研究。
通讯作者：徐邦牢，联系电话：020-81048082。
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