蒋玲丽，王华梁，王雪亮， 鲍 芸，肖艳群
（上海市临床检验中心，上海 200126）
摘要：目的 研制乙型肝炎病毒（HBV）DNA血清二级国家标准物质。方法 用HBV阴性血清将阳性血清稀释为1.00×106IU/mL，以1.5 mL/支分装。评价采用Roche COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan 48检测系统。制备后评价基质互通性；抽取制备物30支，每支检测2次，评价均匀性；检测室温14 d、37 ℃ 7 d、45 ℃ 3 d、2～8 ℃ 6个月和-20 ℃ 12个月的稳定性；评价反复冻融15次、开瓶后放置7 d和模拟运输后的稳定性。定值通过溯源至国家一级标准物质（GBW09150），不确定度包括不均匀性引入的不确定度、长期稳定性引入的不确定度和定值时引入的不确定度。结果 基质互通性实验表明制备物测定的均值在临床新鲜样本95%可信区间内；均匀性实验表明批间不精密度为2.04%，批内不精密度为1.98%（F=1.052 4，P＞0.05）；室温14 d、37 ℃ 7 d、45 ℃ 3 d、2～8 ℃ 6个月和-20 ℃ 12个月的检测结果与第0天/月比较，采用直线拟合法分析，差异无统计学意义（P＞0.05）；反复冻融15次、开瓶后放置7 d和模拟运输（至2家实验室）的检测结果与对照组（-20 ℃）比较，差异无统计学意义（t=0.46、-0.35、1.53、0.75，P＞0.05）。制备物定值为（2.5±0.9）×106IU/mL。结论 制备物达到了国家二级标准物质的要求，可用作核酸扩增检测的HBV DNA标准物质。
关键词：标准物质；肝炎病毒，乙型；DNA
1986年国际病毒委员会正式将人类乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）划归为一个新的病毒科，即嗜肝病毒科［1］。HBV可引起乙型肝炎表面抗原（hepatitis B surface antigen，HBsAg）携带、急性肝炎、慢性肝炎、重症肝炎、肝硬化、肝癌等。抗病毒治疗是乙型肝炎治疗的常用方法，而目前确诊HBV感染状态和监测抗病毒疗效都需要检测HBV DNA。实时荧光定量聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）是目前国内HBV DNA定量检测应用最广泛的方法。虽然我国临床基因扩增检测技术必须通过当地指定机构的医疗技术临床应用能力审核才能开展，在实验室设置和设备、设施和环境、人员资质、样本管理、质量控制、检验报告等环节都进行严格把关，在很大程度上保证了临床实验室分子诊断技术的检测水平和检测质量，但目前国内同一实验室不同检测批次间或不同实验室对同一样本检测结果间的差异，还是成为时常困扰临床医师、患者以及实验室技术人员的普遍性问题。为使不同的实验室间测定结果具有可比性，可通过相应的参考方法或标准物质进行量值溯源，但核酸检测没有参考方法可用，只能通过标准物质来进行量值溯源［2］。
针对标准物质匮乏现状，上海市临床检验中心参考卫生部临床检验中心HBV DNA一级标准物质的研究方法［3］制备HBV DNA二级标准物质［编号GBW（E）090627］，期望该标准物质能更广泛地满足临床实验室的应用需求。
一、 标准物质的制备
1. 阳性血清准备 筛选HBV DNA阳性血清，并检测其抗丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）抗体、抗人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）抗体，确定抗HCV抗体和抗HIV抗体均为阴性。
2. 阴性血清准备 筛选阴性血清，并检测其HBV血清学标志物［HBsAg、乙型肝炎表面抗体（hepatitis B surface antibody，HBsAb）、乙型肝炎e抗原（hepatitis B e antigen，HBeAg）、乙型肝炎e抗体（hepatitis B e antibody，HBeAb）、乙型肝炎核心抗体（hepatitis B core antibody，HBcAb）］以及抗HCV抗体和抗HIV抗体，结果均为阴性，将该冰冻血清在4 ℃复融后，去除沉淀，混合均匀，待用于阳性血清的稀释。
3. 标准物质制备 用阴性血清将阳性血清稀释至HBV DNA含量为1.00×106IU/mL，总量约为1 000 mL。
4. 制备物分装 分装量为1.5 mL/支。
二、仪器与试剂
瑞士罗氏公司生产的Roche COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan 48检测系统及其配套试剂（批号S02567、S01732），方法为内标定量法。美国ABI公司生产的ABI7500全自动扩增仪检测系统，试剂由上海科华生物工程股份有限公司生产（批号14020111），方法为煮沸法。国家一级标准物质（GBW09150）含量为（1.20±0.24）×106IU/mL。
三、方法
1. 基质效应与互通性评价实验 依据中华人民共和国卫生行业标准WS/T 356-2011《基质效应与互通性评估指南》［4］对制备的标准物质进行基质效应与互通性评估验证。从上海市仁济医院收取临床新鲜样本20例，其浓度在103～108IU/mL间随机分布，采用线性回归分析方法［4-5］进行分析。若待测标准物质的测定均值在临床新鲜样本95%可信区间内，且各标准物质与临床新鲜样本相比在检测中表现一致，则认为无明显的基质效应。
2. 均匀性评价实验 从总体样本中采用随机抽样方法抽取30支样本，对抽取的30支样本分别进行检测，每支检测2次。该检测由同一人员进行，并在一批次内完成检测。计算批内和批间不精密度，采用方差分析，若F＜Fα（1.85），则认为是均匀的。
3. 稳定性评价实验 （1）短期稳定性实验：抽取冻存样本20支放置在室温（温度20～25 ℃，相对湿度20%～80%）14 d和10支放置在37 ℃（相对湿度60%～80%）孵箱7 d。室温样本分别在第0、1、5、7、9、11和14天，37 ℃样本分别在第0、1、3、4、5和7天进行检测，每次检测在不同的时间抽取2支，每支检测2次，与第0天的数据进行比较。（2）长期稳定性实验：抽取冻存样本20支放置在冷藏条件（2～8 ℃）6个月，其余放置冷冻条件（-20 ℃）12个月，每月在不同的条件下抽取2支，每支检测2次，与第0月的数据进行比较。（3）加速裂解实验：抽取制备样本6支在45 ℃放置3 d，每天抽取2支，每支检测2次，与第0天的数据进行比较。（4）开瓶稳定性实验：抽取6支样本复融检测后，放入-20 ℃继续冻存7 d取出，每支检测1次，与第0天检测结果比较。（5）反复冻融实验：根据制备样本每支1.5 mL，临床目前最少用量为100 μL，最多可反复冻融15次的情况，抽取6支样本，反复冻融15次后每支检测1次，与第0次结果比较。（6）模拟运输实验：抽取制备样本12支分成2份，寄至上海较远的2家郊区医院（青浦中心医院和崇明中心医院），医院签收后寄回上海市临床检验中心，每支检测1次，与放置在-20 ℃样本结果比较。
4. 定值实验及不确定度评估 评价采用Roche COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan 48检测系统，含量定值通过溯源至国家一级HBV DNA血清标准物质（GBW09150）计算获得。将国家一级标准物质稀释成4个浓度梯度，做标准曲线，制备物重复检测10次，求出制备物的含量。定值结果采用“靶值（
四、统计学方法
所有数据采用log值转换后数据进行统计。用SPSS 16.0和Excel 2007软件进行统计学分析。均匀性实验采用方差齐性检验，短期稳定性实验、长期稳定性实验、加速裂解实验采用直线拟合法评价，反复冻融实验、开瓶稳定性实验、模拟运输实验采用t检验。定值采用溯源至国家一级标准物质计算。以P＜0.05为差异有统计学意义。
一、制备物基质效应与互通性评价
制备物测定均值在临床新鲜样本95%可信区间内，表明无明显的基质效应。见图1。
图1 制备物基质效应分析
注：Y=1.078X-0.880；R2=0.975；
二、制备物均匀性评价
抽取30支样本，每支检测2次，对检测数据进行统计，制备物HBV DNA检测值为（6.15±0.12）log IU/mL，批间不精密度为2.04%，批内不精密度为1.98%（F=1.052 4，P＞0.05）。
三、制备物稳定性评价
1. 短期稳定性 室温条件下，制备物分别在第0、1、5、7、9、11和14天的检测结果与第0天比较，采用直线拟合法分析，斜率无统计学意义（P＞0.05）。在37 ℃条件下，制备物分别在第0、1、3、4、5和7天的检测结果与第0天比较，采用直线拟合法分析，斜率无统计学意义（P＞0.05）。见图2。
2. 长期稳定性 在2～8 ℃条件下，制备物在第1、2、3、4、5、6个月的检测结果与第0月比较，采用直线拟合法分析，斜率无统计学意义（P＞0.05）。在-20 ℃条件下，制备物在第1个月至第12个月每月的检测结果与第0月比较，采用直线拟合法分析，斜率无统计学意义（P＞0.05）。见图3。
图3 长期稳定性实验分析
注：（a）为2～8 ℃条件下的稳定性；（b）为-20 ℃条件下的稳定性
3. 加速裂解实验 在45 ℃条件下，制备物在第1、2、3天的检测结果与第0天比较，采用直线拟合法分析，斜率无统计学意义（P＞0.05）。见图4。
4. 开瓶稳定性和反复冻融实验 制备物在开瓶7 d和反复冻融15次后的检测结果与-20 ℃条件下制备物的检测结果比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。
5. 模拟运输实验 制备物模拟运输后的检测结果与-20 ℃条件下检测结果比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。
图4 45 ℃条件下稳定性实验分析
表1 开瓶稳定性和反复冻融实验 （log IU/mL）
检测次数 -20 ℃ 开瓶7 d 冻融15次1 6.31 6.25 6.39 2 6.34 6.35 6.33 3 6.29 6.39 6.39 4 6.43 6.32 6.43 5 6.34 6.30 6.43 6 6.29 6.31 6.29 x 6.33 6.32 6.38 t值 -0.35 0.46 P值 ＞0.05 ＞0.05
表2 模拟运输实验 （log IU/mL）
检测次数 -20 ℃ 崇明中心医院 青浦中心医院1 6.29 6.44 6.28 2 6.39 6.42 6.33 3 6.38 6.38 6.39 4 6.40 6.36 6.36 5 6.28 6.46 6.32 6 6.43 6.39 6.36 x 6.37 6.41 6.34 t值 1.53 0.75 P值 ＞0.05 ＞0.05
四、定值实验
实验采用国家一级HBV DNA血清标准物质（GBW09150）为溯源，按比例稀释4个浓度，求得回归方程为Y=1.066 2X-0.428 5 （r=0.999 9），制备物重复检测10次，经计算定值为2.5×106IU/mL。相对不确定度计算结果见表3。U=2.5×106IU/mL×36.00%=0.9×106IU/mL，最终该制备物定值为（2.5±0.9）×106IU/mL （k=2）。
表3 不确定度的计算
不确定度来源 x （IU/mL） s（IU/mL） u（%）u均匀性rel 1.47×106 9.43×104 6.41 u稳定性rel 1.70×106 2.23×105 13.11 u定值rel 2.5×106 1.07×105 10.85 ucrel 18.20 Urel 36.00
临床实验室分子诊断现已成为临床检验各学科分支中最具发展潜力的领域，其涉及病原体核酸、人类基因和各种蛋白等大分子的测定，是临床疾病诊断中不可或缺的手段。通常临床实验室分子诊断标准化应包括临床样本采集、运送和保存的标准化，临床样本制备处理和核酸提取方法的标准化，检测试剂和方法的标准化，检测结果分析的标准化以及标准物质和质控物的应用等［6］。其中标准物质是临床分子诊断的核心，其可使临床实验室间的检测数据具有可比性。世界卫生组织于1997年组织多中心合作研制了病毒核酸扩增检测的HBV DNA国际标准品［7］，单位为U/mL。目前在用的为第3代国际标准物质（编号10/264），其含量为8.5×105IU/mL，不确定度为1.29%。国家卫生计生委临床检验中心参考世界卫生组织标准物质的研制方法，研制了HBV DNA标准物质，目前使用的标准物质编号为GBW09150。但是由于上述国际/国家标准品数量有限，更多提供给计量单位或试剂厂家使用，无法满足临床实验室的需求。
临床实验室需要在试剂、仪器以及检测方法更新前对其检测系统进行有效的评价。目前，国内HBV DNA的检测趋势是采用磁珠法替代煮沸法，其最大的优势是检测下限从原来的500～1 000 IU/mL提高为15～20 IU/mL。但随之而来的问题是在性能验证时如果想去准确地验证最低检测下限，标准物质的应用显然是最好的方法。为了更好地满足临床对标准物质的使用，本研究参照国家一级标准物质的制备方法完成HBV DNA制备物的制备后，参照《中华人民共和国国家计量技术规范，一级标准物质》［8］和《标准物质定值原理和统计学原理》［9］对制备物进行评价。由于制备物在制备过程中加入了防腐剂，故依据中华人民共和国卫生行业标准WS/T 356-2011《基质效应与互通性评估指南》对制备物进行基质效应评估，从图1可以看出，制备物测定值在临床新鲜样本95%可信区间内，表明无明显的基质效应。均匀性是标准物质的基本要求之一，但是几乎所有制备物都存在不均匀的可能性，故需要检查标准物质的均匀性［10］。均匀性包括单元间均匀性和单元内均匀性，本研究制备物的批间不精密度为2.04%，批内不精密度为1.98%，满足国家标准物质的均匀性要求。在稳定性方面，分别作了室温（20～25 ℃，相对湿度20%～80%）14 d、37 ℃（相对湿度60%～80%）7 d、冰箱冷藏（2～8 ℃）6个月、冰箱冷冻（-20 ℃）12个月及45 ℃ 3 d的含量变化监测，从图2～图4可以看出，通过直线拟合法分析，斜率均无统计学意义（P＞0.05）。考虑到临床使用的实际情况，本研究对制备物进行了开瓶稳定性检验，模拟临床开瓶后冻存7 d的使用情况以及考虑到目前临床最小使用量为100 μL，而制备物的包装为1.5 mL/支，故反复冻融15次，模拟临床使用的最多次数的情况，结果显示开瓶7 d和反复冻融15次，制备物是稳定的，差异无统计学意义（P＞0.05）。另外，考虑到制备物将来要运输至临床实验室使用，为了评估制备物经过运输后的稳定性，本研究随机抽取制备物运输至路途较远的2家临床实验室后再寄回上海市临床检验中心，结果显示制备物是稳定的，差异无统计学意义（P＞0.05）。最后，制备物的含量确定采用Roche COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan 48检测系统，并通过溯源至国家一级HBV DNA血清标准物质（GBW09150）计算定值为（2.5±0.9）×106IU/mL（k=2）。
综上所述，HBV DNA制备物通过评价满足了国家二级标准物质的要求，顺利通过了全国标准物质管理委员会的评审［编号GBW（E）090627］，该标准物质将更好地满足临床对HBV DNA标准物质的需要，可用于实验室HBV DNA检测的质量控制以及依据该标准物质制备标准系列血清进行试剂方法评价等。
参考文献
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Establishment of a national grade Ⅱ reference material for HBV DNA
JIANG Lingli，WANG Hualiang，WANG Xueliang，BAO Yun，XIAO Yanqun.
（Shanghai Center for Clinical Laboratory，Shanghai 200126，China）
Abstract：Objective To establish a national grade Ⅱ reference material for hepatitis B virus（HBV）DNA. Methods The HBV positive serum was diluted with HBV negative serum. The content was 1.00×106IU/mL，packed to 1.5 mL each bottle. Roche COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan 48 testing system was used. Matrix interoperability was evaluated. For homogeneity evaluation，30 bottles were randomly selected，and each bottle was determined for 2 times. The prepared materials were placed at room temperature for 14 d，37 ℃ for 7 d，45 ℃ for 3 d，2-8 ℃ for 6 months and -20 ℃ for 12 months，and the stabilities were evaluated. The stabilities of the prepared materials which were repeated freezing and thawing for 15 times，7 d after the opening of bottles and simulated transportation to 2 laboratories were evaluated. The quantity of prepared materials was traced to the national standard material（GBW09150）. The uncertainties included the introduction of heterogeneity，the long-term stability and the quantity. Results Matrix interoperability test showed that the prepared materials' mean value was within the 95% confidence interval of clinical fresh samples. The between-run imprecision was 2.04%，and the within-run imprecision was 1.98%（F=1.052 4，P＞0.05）. The stability test indicated the prepared materials were stable at room temperature for 14 d，37 ℃ for 7 d，45 ℃ for 3 d，2-8 ℃ for 6 months and -20 ℃ for 12 months，and the slope rates had no statistical significance compared with the 0th day/month by linear fitting test（P＞0.05）. The stability was observed in prepared materials which were repeated freezing and thawing for 15 times，7 d after the opening of bottles andsimulated transportation to 2 laboratories with no statistical significance compared with prepared materials which stored at -20 ℃（t=0.46，-0.35，1.53 and 0.75，P＞0.05）. The quantity was（2.5±0.9）×106IU/mL. Conclusions The prepared materials have reached the requirements of national grade Ⅱ reference material，which can be used as a reference material for nucleic acid amplification for HBV DNA.
Key words：Reference materials ；Hepatitis B virus；DNA
（收稿日期：2015-07-06）
（本文编辑：姜 敏）
基金项目：上海市卫生和计划生育委员会重要疾病联合攻关项目 （2013ZYJB0010）
作者简介：蒋玲丽，女，1980年生，硕士，主管技师，主要从事免疫学和分子生物学的质量控制工作。
通讯作者：肖艳群，联系电话：021-68316300-2303。
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