水春雨
(中国铁道科学研究院节能环保劳卫研究所，北京 100081)
摘 要：应用好氧曝气生物流化床反应器处理动车集便器粪便污水，研究反应器同步硝化反硝化脱氮效果；考察不同影响因素条件下反应器脱氮效果。结果表明：反应器能够较好地同时实现硝化和反硝化两个过程；DO为2.5 mg/L时，同步硝化反硝化脱氮效果最佳；最佳pH值范围为7.0～8.0；反应器在C/N比为1.6时脱氮效果较好；温度在18～25 ℃变化，对反应器脱氮效能影响不明显；微生物DNA纯度高，氨氧化细菌的生物多样性高。
关键词：同步硝化反硝化；粪便污水处理；脱氮；微生物
随着环境保护意识逐渐加强，我国列车粪便由沿线直排式转变为统一收集处理[1]；相比其他粪便污水水质，铁路动车集便器粪便污水水质具有氨氮浓度高、C/N值低，处理难度大等特点[2]。如何处理铁路动车集便器粪便污水中的高氨氮，使其达标排放，成为铁路环保面临的新课题。
目前关于有效处理粪便污水已做了大量研究，Junzo等[3]采用光化学菌结合好氧的方法处理粪便废水，Hiroki等[4]研究了间歇曝气对粪便污水生物脱氮的影响，结果表明，曝气和缺氧运行的时间比影响N2O产量，外加碳源可减少N2O产量。传统的生物脱氮工艺在污水脱氮方面起到了一定的作用，但系统存在难以维持较高的硝化菌浓度，且须同时进行污泥回流和硝化液回流等问题[5]。Klangduen等[6]研究发现在同一反应器中同步发生，能同步实现硝化反硝化脱氮反应并去除有机物，并且能有效维持反应器中pH值稳定且无需回流，在深度脱氮技术中逐渐得到重视。
研究发现适当控制各种影响因素条件，可以在污泥絮体中或生物膜内同时形成好氧和缺氧微环境，有利于反应进行。本实验考察了DO、C/N比、温度和pH值等因素对曝气生物流化床反应器同步硝化反硝化脱氮的影响，并研究了氨氧化菌生物多样性。
1.1 实验仪器、材料
分光光度计(ND-1000)，水温计，pH计，变阻电炉、酸式滴定管，JHE-2型微生物载体。四级串联曝气生物流化床反应器如图1所示。
图1 曝气生物流化床反应器实验装置示意
实验用水取自动车段密闭式厕所粪便污水，水质情况如表1所示。
表1 实验水质情况
水质参数pHCOD/(mg/L)NH3-N/(mg/L)TN/(mg/L)浓度范围9.06000～80003000～45004000～6000
1.2 实验方法
1.2.1 DNA提取实验
称取一定质量的流化床反应器中的生物载体放入100 mL超纯水中，超声波振荡30 min后，取出载体，将悬浮溶液于8 000 r/min转速下离心5 min，弃去上清液，用PBS缓冲液洗涤离心后的沉淀物，再离心、弃去上清液，取0.5 g沉淀物，用Fast Soil DNA提取试剂盒提取样品中的总DNA。采用Nano-drop分光光度计测定提取的总DNA。
1.2.2 氨氧化细菌amoA特异性扩增实验
采用氨氧化细菌氨单加氧酶的特异性引物amoA-1F/ amoA-2R进行PCR扩增，扩增产物片段为491bp。
amoA-1F∶5′-GGGGTTTCTACTGGTGGT-3′；
amoA-2R∶5′-CCCCTCKGSAAAGCCTTCTTC-3′。
扩增体系为(50 μL)：10×buffer5 μL，dNTP(2.5 mmol/L)4 μL，正反向引物(浓度为10 mmol/L)各1 μL，BSA0.5 μL，Taq酶(2.5U)0.25 μL，稀释DNA模板2 μL，ddH2O补足至50 μL。反应条件：94 ℃，5 min；变性：94 ℃，1 min；退火：60 ℃，1 min；延伸：72 ℃，1 min；循环30个周期：72 ℃，5 min；4 ℃恒温。
2.1 DO的影响
实验进水水质为：COD浓度8 000 mg/L左右，氨氮浓度3 400 mg/L左右，总氮浓度5 100 mg/L左右，pH值8.5～9.0，HRT 18 h，温度22 ℃，调整溶解氧浓度(DO)，考察不同DO对反应器同步硝化反硝化脱氮效果的影响，如图2所示。
图2 DO对同步硝化反硝化脱氮效果的影响
由图2可以看出，一级曝气生物流化床反应器对氨氮去除率达77.5%、TN去除率达63.1%左右，曝气生物流化床反应器中存在显著的同步硝化反硝化现象。当DO从1.5 mg/L升高至2.5 mg/L时，氨氮去除率随着DO的升高而增加；继续增加DO量，氨氮和总氮去除率有所降低；当DO为2.5 mg/L时，总氮的去除率达到最高，反应器中取得了最好的脱氮效果，氨氮去除率为77.5%，总氮去除率为63.1%。
由图2可以看出，在较高DO浓度为3 mg/L时，反应器脱氮效果下降，继续增加溶解氧浓度到4.0 mg/L时，氨氮去除率74.8%，总氮的去除率仍能达到57.9%，反应器也能达到较好的同步硝化反硝化脱氮效果；原因可能是一方面实验选用的生物载体填料表面呈波纹状、凹凸不平，在表面凹陷处易形成较厚生物膜，溶解氧不易穿透至生物膜最深处，从而在生物膜最内侧形成厌氧微环境[7，8]；另一方面DO值高，大的曝气量增加了对混合液的吹脱，而一级反应器内混合液pH值在8.5以上，呈碱性，存在游离氨，易被吹脱出去，增大脱氮效果。本实验将DO控制在2.5 mg/L左右，硝化速率和反硝化速率更加接近，总氮的去除效果较好。
2.2 C/N比的影响
有机碳是微生物能量代谢的主要来源，在异养反硝化过程中，有机碳起着相当重要的作用[9]。氨氮除了为细胞提供同化合成氮源外，还是硝化菌生长的能源，脱氮效率与进水C/N比有关，C/N比影响生物硝化速率[10]。
实验进水水质为：原水COD浓度8 000 mg/L左右，氨氮浓度3 400 mg/L左右，总氮浓度5 100 mg/L左右，pH值8.5～9.0，HRT18h，实验中DO为2.5 mg/L，通过向原水中投加葡萄糖，配制不同C/N比值的污水，考察不同的C/N(COD/TN)比对反应器同步硝化反硝化脱氮的影响，见表2。
表2 C/N比对同步硝化反硝化脱氮效果的影响
C/N进水氨氮/(mg/L)出水氨氮/(mg/L)氨氮去除率/%进水总氮/(mg/L)出水总氮/(mg/L)总氮去除率/%1.63478.8889.974.45128.31989.661.23.53471.4912.873.75139.21889.363.25.53420.1920.373.15106.91755.165.6
由表2可以看出，在实验条件下，C/N比对氨氮去除率影响不大；原因是流化床反应器污泥龄(SRT)时间长，载体生物膜中能够存活世代时间较长的微生物，有利于硝化反应进行，提高C/N比没有对硝化反应产生较大的影响[11]。随着C/N比的提高，总氮去除效率升高；原因是随着C/N比的提高，反硝化过程所需要提供的有机碳源更加充足，利于反硝化反应[12]。在进水氨氮浓度3 478.8 mg/L、C/N比值1.6的条件下，一级反应器取得了74.4%的氨氮去除率，61.2%的总氮去除率，反应器在低C/N比条件下表现出良好的同步硝化反硝化脱氮性能；后期实验选择C/N比值为1.6。
2.3 pH值的影响
pH值是影响硝化反应的重要因素，硝化细菌对pH值十分敏感[13]。在不补充碱度的情况下，随着硝化反应的进行，pH值会迅速降低。保持其他反应条件不变，向第四级反应器投加氢氧化钠溶液，调整反应器内混合液pH值，考察不同pH值对反应器同步硝化反硝化的影响。第四级反应器进水水质情况为：COD 900 mg/L左右，TN 1 200 mg/L左右，氨氮90 mg/L左右，考察不同pH值条件下对反应脱氮的效果影响，见表3。
表3 pH对反应器同步硝化反硝化脱氮效果的影响
pH进水氨氮/(mg/L)出水氨氮/(mg/L)氨氮去除率/%进水总氮/(mg/L)出水总氮/(mg/L)总氮去除率/%7.097.58.591.31243.7868.330.26.093.139.557.61216.91046.814.07.0101.511.588.71224.4861.229.78.096.27.392.41219.2849.130.4
由表3可以看出，pH值从7.0下降到6.0时，氨氮和总氮去除率均下降，降低pH值影响到硝化菌和反硝化菌的增殖和活性，硝化反应和反硝化反应受到抑制；当pH值从6.0回升到7.0时，氨氮和总氮的去除率均回升至原处理水平，表明较低的pH值会抑制硝化细菌和反硝化菌的活性，短期内没有对硝化细菌和反硝化菌发生毒害作用。pH值从7.0上升到8.0时，氨氮和总氮去除率基本保持稳定，Antoniou等[14]研究表明硝化过程中pH值在7.0～8.0范围内对硝化速率影响较少。
反应器中对TN去除效率均较低，这主要是因为其C/N比较低，只有0.75左右，不能满足反硝化反应对碳源的需求。硝化反应中，每氧化1 g氨氮需要消耗碱度7.14 g(以CaCO3计)，而反硝化反应中，每还原1 g NO3—N将产生3.57 g碱度。在同一反应器中发生同步硝化反硝化反应时，反硝化反应产生的碱度可以部分补充硝化反应消耗的碱度。由于粪便污水pH值较高，原水存在一定的碱度，需要额外补充的碱度少[15]。实验研究表明，在曝气生物流化床反应器中，实现同步硝化反硝化的最佳pH值范围应控制在7.0～8.0。本实验中，反应器稳定运行4个月，前两级反应器在未曾补充碱度的情况下，一级反应器pH值稳定在8.4左右，二级反应器pH值稳定在7.5左右，pH值能够稳定维持在偏碱性。原因是：一方面，前两级反应器对氨氮去除率90%左右，总氮去除率65%左右，这一去除量已经大大超出了细菌对TN的同化作用去除量，推断出曝气生物流化床反应器中发生了比较充分的同步硝化反硝化反应，反硝化反应产生的碱度部分补充了硝化反应消耗的碱度[16]；另一方面，动车集便器粪便污水pH值高，在9.0以上，可为硝化反应补充提供部分碱度。
2.4 温度的影响
在影响微生物生理活动的各项因素中，温度的作用非常重要。研究表明，硝化反应的最适温度20～30 ℃，反硝化反应最适温度20～40 ℃，温度低于15 ℃，反硝化菌和硝化菌增殖和代谢速率均降低，温度高于30 ℃，硝化菌活性受到抑制[17]。实验期间除进水浓度有所波动外，原水COD浓度8 000 mg/L左右，氨氮浓度3 400 mg/L左右，总氮浓度5 100 mg/L左右，pH值8.5～9.0，HRT 18 h，实验中DO为2.5 mg/L，考察在不同水温条件下氨氮和总氮的去除效果影响，见图3。
图3 温度对反应器同步硝化反硝化脱氮效果的影响
由图3可以看出，四级反应器对氨氮总去除率99.6%～99.9%，TN的总去除率82.2%～87.1%，温度在18～25 ℃波动，对反应器中硝化反应及反硝化反应影响不明显，反应器对氨氮、TN去除率均比较稳定；原因是：一方面，温度在18～25 ℃，基本在硝化菌和反硝化适应温度范围；另一方面，四级反应器总水力停留时间较长(HRT 72 h)，使得同步硝化反硝化反应充分进行[18]。
2.5 DNA提取结果
采用FAST试剂盒提取DNA，操作简便，DNA的纯度高，腐殖质和其他杂质含量较少，对后期PCR扩增抑制作用小，提取的总DNA用Nano-drop分光光度计测得其浓度为259.72 ng/μL。由图4可以看出：DNA在250～260 nm下游最大吸收值，且峰值单一，OD260/OD280=1.91，一般情况下，若该数值在1.6～2.0之间说明DNA纯度较高。
图4 DNA的提取结果
2.6 氨氧化细菌的PCR结果
采用特异性引物amoA-1F/amoA-2R对生物膜DNA样品的氨氧化细菌进行PCR特异性扩增后，琼胶电泳获得的电泳见图5。
图5 AOB的aomAPCR电泳图
由图5可知，图中前两个孔为阴性对照，以检验在实验过程中DNA样品是否被污染，而出现假阳性结果；第3个孔为Marker，在DNA分子凝胶电泳时，用来检测琼脂糖凝胶是否有问题，同时比对样品DNA的片段长度(本实验选择AOB片段为436 bp)，后3个亮条带(2组平行)为生物膜样品氨氧化细菌PCR特异性条带，由图5显示，采用PCR法已成功扩增出氨氧化细菌AOB的特异性片段。
2.7 氨氧化细菌的系统发育树的构建
将测得的序列结果与网上数据库BLAST进行对比，从序列库中挑选出与实验样品序列同源性和相似性最近的的DNA序列，通过专门的系统发育树绘制软件，建立氨氧化细菌的系统发育树[19]。
曝气生物流化床反应器中的氨氧化细菌(AOB)的amoA功能基因系统发育树可以划分为6个分支，均属于β-Proteobacteria。其中，3个分支包含已知菌种的amoA功能基因序列，分别定义为Nitrosomonas分支、Nitrosospira分支和Nitrosovibrio分支，3个分支未找到相似的已知菌种amoA功能基因序列，均定义为未知Nitrosomonadaceae分支，已知菌属占《伯杰氏系统细菌学手册》中氨氧化细菌5个属中的3种，由此可以看出曝气生物流化床反应器中的氨氧化细菌的生物种群数量分列广泛，通过OTU计算曝气生物流化床反应中氨氧化细菌序列共整理出6个氨氧化菌的操作分类单元(OTU)，OTU直接反应的是微生物的生物多样性，由此可以明显表明，曝气生物流化床小试反应器处理列车集便器粪便污水，高效的脱氮效率与反应器中氨氧化细菌种属多、生物多样性高有关，氨氧化细菌的丰富多样性可能是曝气生物流化床反应器高效脱氮的一项重要原因。
(1)DO在2.5 mg/L时，反应器达到最佳同步硝化反硝化效果；增大DO值，反应效率反而变小。C/N比变化对反应器氨氮去除率影响不大，总氮去除率与C/N比值成正相关。在C/N比值1.6的条件下，反应器表现出良好的同步硝化反硝化脱氮性能。
(2)好氧曝气生物流化床反应器，能够较好实现硝化和反硝化2个过程，最佳pH值范围为7.0～8.0，pH值低于7.0，反应器同步硝化反硝化效能下降。温度在18～25 ℃变化对氨氮和总氮去除率变化较小。
(3)DNA提取结果表明OD260/OD280=1.91，纯度较高，浓度为259.72 ng/μL；氨氧化细菌AOB通过构建系统发育树可以划分为6个分支，列属于硝化细菌5个属中的3个属，20个序列含有6个OTU，氨氧化细菌的生物多样性高。
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SHUI Chun-yu
(Energy Saving & Environmental Protection & Occupational Safety and Health Research Institute， China Academy of Railway Sciences，Beijing 100081，China)
Abstract：The enclosed passenger train toilet fecal wastewater is treated with the aerobic biological fluidized bed reactor.The efficiencies of simultaneous nitrification and denitrification in reaction are studied and the effects of denitrification with reactor are assessed under different conditions.The results show that the reactor can well fulfill nitrification and denitrification processes simultaneously with the best denitrification performance at DO of 2.5 mg/L.The optimal pH range is 7.0～8.0 and at C/N=1.6 the reactor has better efficiency of denitrification.In addition，it is observed that the performance is not significantly influenced by the temperature changes between 18～25 ℃，ant the purity DNA of microorganism and the biodiversity of ammonia oxidizing bacteria are high.
Key words：Simultaneous nitrification and denitrification; Fecal wastewater treatment; Denitrification; Microorganism
收稿日期：2016-03-15；
修回日期：2016-03-31
基金项目：铁道部科技研究开发计划项目(J2009Z002)
作者简介：水春雨(1978—)，男，副研究员，工学博士，主要从事铁路节能环保技术工作，E-mail：shuicy@rails.cn。
文章编号：1004-2954(2016)10-0145-04
中图分类号：X703
文献标识码：A
DOI：10.13238/j.issn.1004-2954.2016.10.032
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