(1)悠久的历史
自从我们这个星球有了生物,酶就存在了。毫不夸张地说,我们的生命无时无刻都不能离开酶,我们的生活也与酶的应用息息相关。远在四千年前,我国人民就开始了利用大麦芽中的酶制造饴糖,利用发酵法酿酒,制醋和酱。但那时人们并不是有意的利用酶,是一种只知道结果,不知道原理的自然行为。人们在这种状态下使用了几千年的酶,在100多年前的1857年,法国的微生物学家巴斯德在研究酒精发酵时发现,把活的酵母与糖放在一起,在适合的条件下,会进行发酵产生酒精。又过了40年,1897年德国的毕希纳进一步研究发现,如果将能够引起酒精发酵的活酵母研磨碎,再与糖混合,仍然可以使糖发酵形成酒精。这说明即使酵母细胞不存在了,但细胞内的物质仍然能够使糖发酵成为酒精,并把这种具有发酵能力的物质称为酶。到20世纪初,发现了更多的酶,对它们催化的反应进行了大量研究,并把它们从细胞中分离出来,进行纯化。1926年桑讷首先得到了能够分解尿素的脲酶结晶,研究证明它是蛋白质,具有蛋白质的一切性质。为此荣获1947年度的诺贝尔奖。之后有关酶的研究获得发展,成为一个独立的学科。到60年代以后,随着物理和化学的发展,为酶学研究和应用提供了强有力的技术手段,酶学研究和应用真正进入了迅速发展时期。淀粉酶和葡萄糖淀粉酶首先在工业上用于生产葡萄糖酶。70年代初,日本的千佃一郎将固定化氨基酸酰化酶用于工业生产L-氨基酸,开创了应用固定化酶的新时代;随着酶的应用的不断扩大,生物技术的发展,人们将有关酶的开发,研究,制备,加工及应用统称为酶工程。80年代初人们发现酶也可以在有机溶剂中催化反应,改变了酶不能在有机溶剂中使用的传统观念,使酶学,酶工程和酶的应用进入了全新世纪。
2)什么是酶?
酶是存在于生物体内的一种生物催化剂。和普通的化学催化剂一样,它可以提高化学反应的速度,但不能改变反应方向和反应平衡。它与化学催化剂不同的是,它本身是种蛋白质。我们知道,蛋白质是由各种氨基酸按一定的排列顺序组成,形成蛋白质的肽链,它如同一条很长的线,弯曲,折叠形成一个比较松散的‘团’,每一种酶蛋白质形成的‘团’并不是杂乱无章的,它是按照一定的规则形成。因此,每一种酶蛋白质都具有相同的结构和固定的形态。就是由于这种独特的结构使组成肽链的某些氨基酸的侧链形成固定的空间排部,构成具有催化能力的活性中心。而蛋白质肽链之间的相互作用,使‘线团’中的‘线段’固定了位置和走向,也使活性中心固定下来。
酶的这种‘线团’结构,只有在正常条件下才是稳定的,一旦周围环境条件发生变化,或其它因素的影响,这个‘线团’就可能被打乱,乱了套的酶蛋白质的催化能力也随之丧失,这种现象称为变性。一般来说,高温,强酸,强碱,有机溶剂都会使酶蛋白发生变性而失去活性。
3)酶在生物体内的作用是什么?
每一种生物的生命过程,从小到大,繁衍生息,生老病死,新陈代谢,都和酶有关。如果没有酶的催化,于性命攸关的最基本的食物消化,氧的呼吸都不可能进行,更不要说其它问题。实际上生物体内发生的各种反应几乎都是由酶催化进行。可以说没有酶也就没有生命。
酶在生命中如此重要,其原因在于酶催化的反应速度快,要比化学催化剂催化的反应大约要快几千倍到上亿倍。比如食物中的葡萄糖与氧反应,变成二氧化碳和水,释放能量是维持生物体体温和一切活动的能源。如果没有催化剂,在常温常压条件下,需要几年或更长的时间。若要反应加快速度,必需在三百度以上才能进行,燃烧氧化,释放能量。这在生物体内是绝对不可能的。而在生物体内,在一系列酶的催化作用下,于常温常压下可瞬间完成,其速度之快难以想象。
另一个原因是一种酶只催化一种物质发生一种反应,或者化学类似物质的相同反应,对其它物质和反应绝对不会有催化作用;绝大多数酶只催化一种物质的一种反应,即使结构非常相似的物质也不会反应。这种性质被称为酶催化的专一性。比如葡萄糖氧化酶,只催化葡萄糖的醛基氧化为葡萄糖酸一种反应,决不会催化葡萄糖的其它基团反应,更不会催化其它物质的氧化反应。为了完成生物体内的成千上万物质的变化和反应,就需要相应的酶,有人估计,在生物体内大约存在1023种酶。是它们保证了生命过程的正常进行,一旦由于某原因造成某一种酶的缺失,或催化活性低下,生物的新陈代谢就会不正常,进而发生疾病,甚至死亡。
4)酶催化的反应特点
酶在生物体内所处的环境十分温和,因在细胞内存在大量的水,酶基本处于水溶液中,近似于中性的酸碱度,低浓度的盐分,温度适中,接近室温,压力很低,接近一个大气压。这也就是大多数酶催化反应所需的条件。
如果将酶从生物体内分离出来,给予相应的反应条件,也可以在体外催化反应,人们可以利用它来生产需要的产品。与化学方法相比,它不需要化学反应的高温,高压,强酸,强碱,大量的有机溶剂和贵重的化学催化剂,只需在常温,常压,接近中性的水溶液中进行反应;需要使用的反应容器也不必用耐压,耐腐蚀的材料制造;生产过程消耗的能量大大降低,生产的成本也低。
由于酶催化的反应具有极高的专一性,它只催化一种物质的一种反应,只产生一种产物,反应条件又温和,反应过程中副反应少,生产的效率高。这也是化学反应无法比拟的。由于酶催化的反应很少需要使用更多的化学试剂和有机溶剂,反应产生废弃物和副产物少,基本不会对环境造成重大污染。
由于以上的优点,酶的应用成为人们十分关注的事情。但是在应用过程中人们也十分关注酶本身和它催化反应的缺点。这就是酶十分娇气,不稳定,在反应过程中受到多种因素的影响会发生变性,逐渐丧失催化活性,如果条件控制的不好反应难于进行到底。另外,酶是水溶性的,反应完了酶与产物混合在一起,即使酶在反应过程中没有失活,还可以再次使用,但是从反应混合物中回收十分困难,一般是只使用一次,反应结束酶也就废弃了。这样酶反应也只能是象做饭一样,‘一锅一锅’的,按批次的方式进行,很难实现连续化生产;由于酶的生产比较复杂,酶也比较贵,使用一次就废弃也是一种浪费,会增加生产成本。
能不能改变酶的这种缺点,使之变得稳定,不溶于水,容易从反应物中分离反复使用,以便实现连续化生产?现在的回答是:可以的。酶的固定化可以解决这一问题。
5)什么是固定化?
酶的固定化是指把酶或含有酶的细胞与固体材料(在这里称为载体)结合在一起,制成不溶于水的颗粒,纤维或膜状物,用于催化反应。随着固定化技术的发展,目前把利用半透膜将酶或含酶细胞包装在一个特定的空间,如微型胶囊内,或超滤器内也称为固定化;甚至于把酶结合在水溶性的大分子上,在反应时为溶解状态,它催化的反应与未固定化的游离酶很相似,反应之后,通过改变条件再使结合酶沉淀出来,这种形式也是一种很好的固定化方法。
6)固定化方法
固定化技术经过近三十的发展,已经比较成熟,大体上可以分为五种。但不论使用那一种方法,都需要使用酶所依附的载体。虽然不同固定化方法对使用的载体有不同要求,但可以根据它们的化学属性分为有机材料载体和无机材料载体,按它们的来源又可分为天然载体和人工合成载体。不管怎样分类,最经常使用,而且比较适合的载体主要有纤维素,明胶,从蟹壳中提取的壳聚糖,从海藻中提取的琼脂,卡拉胶等天然有机载体;人工合成的有机载体主要是聚丙烯酰胺,聚丙烯酸,聚乙二醇(PEG),聚乙烯醇(PVA),含有异硫氰基、环氧基、氨基、巯基、重氮基等各种活性基团的聚合物和各种离子交换树脂;无机天然载体可以是天然沙,石英,澎润土,以及加工过的皂土,硅藻土,白土等;无机合成载体有多孔玻璃,硅胶,以及以它们为基质的有机聚合物包涂或活化的载体。载体的选择主要是根据固定化方法和用途。
经常使用的固定化方法是通过化学反应将酶化学结合到载体上。酶蛋白分子含有氨基、羧基、羟基、巯基等化学基团,它们可以和许多活泼的活性基团进行化学反应形成化学键。利用这一方法时,首先要利用化学方法将载体进行活化,使载体带上能够与酶蛋白的化学基团反应的活性基团。然后在一定条件下使酶蛋白与活化的载体进行反应,就可以实现将酶结合到载体上制备固定化酶的目的。
这种方法一般只实用于酶的固定化,很少用于固定化细胞。因为载体和细胞之间比较难于形成化学键。利用这种方法形成的化学键很牢固,酶不容易从载体上脱落,制备的固定化酶比较稳定。但由于化学反应较激烈,固定化时酶容易发生变性失活,如果固定化条件控制的不好,制备的固定化酶活性较低。
另一个经常使用的固定化方法是将酶或细胞与可以形成凝胶的物质,如明胶、琼脂,卡拉胶,PVA或乙基纤维素的溶液混合,然后采用降温,或凝固剂处理的方法使其凝固形成凝胶,或直接制成颗粒,就可得到实用的固定化酶或固定化细胞。由于凝胶中的高分子形成立体的网状结构,将酶分子或细胞被网络在凝胶格子中,就象棉花中夹带的沙子,因此这种方法称为包埋法。
包埋法的优点是方法简便,实用性较好。但是包埋法更适合细胞的固定化,因为细胞要比酶分子大的多,包埋材料形成的凝胶网格较大,细胞较大容易保留住,而酶比较小,容易从凝胶网格中漏出。另外由于酶和细胞被凝胶材料包裹,对于酶催化的物质和产物的进出具有很大的阻挡作用,如果酶是催化大分子如淀粉、蛋白质、核酸水解的酶时,包埋法制备的固定化酶或细胞活性很低。
如果使用的载体是离子交换树脂,因为它带有离子交换基团,可以和酶及细胞表面的酸性基团如羧基、苯酚基,碱性的氨基、亚氨基等进行离子交换,形成离子键,将酶固定化在离子交换树脂表面。另外象硅藻土,皂土,白土,沙粒等一类物质的表面对酶和细胞都具有很强的吸附能力,也可以用于制备固定化酶和固定化细胞。这种固定化方法十分简便,但是因为离子键和简单的物理吸附很容易受到环境中的盐浓度,酸碱度和温度变化的影响,而解离。因此,用这样的方法制备的固定化酶很不稳定。但是它也有它的优点,固定化酶使用一定时间后,酶脱落丢失,固定化酶活性降低,可以再加入新的酶,进行吸附,可使固定化酶活性恢复,也就是载体可以反复使用。
另外可以利用双功能试剂将酶或细胞联接起来,形成更大的颗粒。双功能试剂的作用就象两只手,把细胞或酶拉在一起。这样制备的固定化酶和固定化细胞在性质上更接近原来的酶和细胞,作为工业催化剂使用还是比较困难。但是,用双功能试剂处理吸附和包埋法制备的固定化酶或细胞,可以将酶或细胞交联,能够防止酶和细胞从固体颗粒上和包埋材料中脱落,使之稳定化。
这种交联固定化方法的最大用途是制备固定化酶膜和固定化细胞膜,这种酶或细胞膜与各种电极、场效应管结合,制备酶电极,用于测定和分析各种物质。如固定化葡萄糖氧化酶膜与pH电极结合可以直接测定葡萄糖,在临床上用于测定血糖和尿糖,作为诊断疾病的工具。
还可以将酶包裹在微型胶囊中,这种胶囊的大小只有几个微米,甚至更小,形成微型胶囊的膜是一种半透膜,上面的孔径大小只容许小分子物质通过,而大分子不能,保证了酶被保留在胶囊内,而其它小分子可以自由进出。制备微型胶囊半透膜的材料大部分是人工合成的高分子材料,如尼龙,聚砜,聚酯等。微型胶囊固定化的酶具有广泛地的应用,如微型胶囊化的脲酶可以分解尿素,用于制造人工肾,在体外循环处理血液,可以治疗尿毒症。其优点是作为非人体蛋白的脲酶在处理血液时不会与血液直接接触,不会产生免疫反应,可以长期的进行血液处理。
7)固定化酶和细胞的特点
酶和细胞固定化后稳定性一般有较大的增加,包括耐热性,耐酸碱性和耐受机械搅拌造成的剪切力。这种变化对于酶的应用十分重要,使酶可以长期反复使用。克服了天然酶的固有缺点。
固定化酶和细胞可以制备成为水不溶性的颗粒、纤维或薄膜,改变了酶的水溶性和细胞颗粒太小,不定型的缺点。在催化反应完成后,通过简单的过滤,就可以回收固定化酶和细胞,重新加入反应物可以继续进行反应,解决了酶和细胞回收困难的问题。也可以将固定化酶或固定化细胞装在圆筒柱状的反应器中,使反应物从一端连续流入,控制流速和其它反应条件,在柱反应器内不断进行反应,产物从柱反应器的另一端流出,这样就可以连续不断地进行反应,连续不断地生产产品,实现了酶催化反应的连续化,为自动化生产创造了条件。所以可以说,固定化技术是实现酶加工工业现代化的基础。
酶和细胞固定化技术也为扩大酶的应用打下了基础。如上面提到的生物传感器的构建,人工脏器的构建,如果使用天然酶和细胞,很难在这些方面应用。
酶固定化后它催化的反应性质也多少有变化,比如催化大分子象淀粉、蛋白质和核酸水解的水解酶类的淀粉酶、蛋白酶和核酸酶的活性降低的较多,原来催化由大分子链末端开始水解的能力降低,而从大分子链的中间水解的能力增加。这种变化对于某些应用有其好处的一面,也有不利的一面。这也说明,任何事物都具有两重性。
8)抗生素的酶法改造
青霉素和头孢霉素,由于它们抗菌谱广、低毒,成为在临床上广泛应用的抗生素,但由于长期的不合理应用,也使许多致病菌产生抗药性,使其临床应用效果大大降低。研究表明,利用酶催化的反应可以进行结构改造,获得新的高效半合成的青霉素和头孢霉素,能够解决上述问题。
青霉素和头孢霉素都是由母核和侧链两部分构成的,母核是产生抗菌活性的核心,侧链与抗菌谱及其稳定性有关。改变侧链可以提高抗菌活性和稳定性,也可部分解决抗药性和过敏问题。因此,进行结构改造成为发展新的半合成抗生素的关键。
所谓的结构改造是指以发酵法生产的天然青霉素为原料,通过能够将侧链水解下来的青霉素酰化酶的作用,使之水解为母核和侧链两部分,将母核回收,然后再用化学方法或青霉素酰化酶催化的合成反应,与新的侧链反应合成新的半合成青霉素,如现在临床上广泛使用的氨苄青霉素,羟氨苄青霉素等。
青霉素酰化酶是由微生物产生的,可以直接使用产酶的大肠杆菌细胞作为酶来使用,也可以使用分离得到的酶进行催化反应,但它们如果不固定化,使用十分不便,使用一次因为不能回收,只好废弃。花费很大力气和财力生产的酶白白浪费掉了。而且由于酶从催化的反应物中除去也很困难,往往会污染产物,影响生产的母核质量。现在在工业上大多数都是采用固定化青霉素酰化酶或固定化细胞进行母核的生产。
利用包埋法制备固定化产生青霉素酰化酶的大肠杆菌细胞,或利用化学结合法将分离得到的青霉素酰化酶结合在适当的载体上制备固定化酶,它们均可用于以青霉素为原料的母核6-APA(化学名称为6-氨基青霉烷酸)的生产。首先将固定化青霉素酰化酶或固定化细胞的颗粒或纤维,填充在柱型反应器中,利用图中所示的简单设备,在循环泵的作用下,使10??青霉素溶液连续快速循环流过固定化酶反应器,由于青霉素水解产生苯乙酸和母核6-APA,会使反应液的pH不断下降,当反应液的pH低于6时,青霉素水解反应就会停止,为保证反应的不断进行,需要对反应液的pH进行调整,保持在pH8-8.5,可以使水解反应很快完成,青霉素的水解率可到达98?¥上。完成水解反应的反应液移出反应系统,进行母核的回收和纯化得到产物。柱反应器经适当的清洗,重新加入新的反应液进行下一批的反应。固定化酶反应器可以使用相当长的时间。通常一公斤固定化青霉素酰化酶可以生产一吨的青霉素母核6-APA。因此可见固定化酶具有很高的生产效率。
另外,将母核6-APA和新的侧链如苯甘氨酸甲酯的混合溶液,在pH4.5的条件下通过固定化青霉素酰化酶柱式反应器,还可以催化合成氨苄青霉素。因此,利用固定化青霉素酰化酶不仅可以生产半合成抗生素的母核,还可以催化合成半合成青霉素。这样一种生产方式大大提高了半合成抗生素的生产水平,解决了工业化生产的问题。该生产技术的产业化大大地改变了半合成抗生素的生产面貌。
9)高果糖糖浆的生产
高果糖糖浆是应用于食品和饮料行业的重要甜味剂,它的甜度和蔗糖相当,是目前利用固定化酶生产的最大宗的产品,也是应用固定化酶技术的高新产业代表之一。
高果糖糖浆的生产是以淀粉为原料,经过高温酸水解制备成葡萄糖,但由于酸水解会产生大量的有色和苦味的物质,使葡萄糖的纯化变得复杂。现在大多数是利用淀粉酶和糖化酶的联合作用从淀粉制备葡萄糖,它不存在高温酸水解的问题,制得的葡萄糖收率高,质量好。然后再通过叫做葡萄糖异构酶的酶催化将葡萄糖转化为果糖,这个反应只能将42??葡萄糖转化为果糖,反应到达平衡,因此制备的糖浆中含有55??葡萄糖,42??果糖和3??寡糖。
在葡萄糖异构酶的固定化技术成功以前,利用上面方法进行高果糖糖浆的生产很难实现。因为使用从微生物细胞分离的葡萄糖异构酶需要进行大规模的反复生产,成本高,但是只使用一次就废弃了;由于酶制剂存在大量杂质,带入产品中,影响了产品质量。自从80年代之后,葡萄糖异构酶的固定化技术日臻成熟,大规模利用固定化葡萄糖异构酶生产高果糖糖浆才得以产业化。目前利用固定化葡萄糖异构酶生产高果糖糖浆的大型企业的生产能力到达万吨。
在工业上,一般是利用适当的包埋载体将酶和产酶的细胞一起包埋,制成珠状固定化酶;也可以利用适当的吸附载体,利用吸附法制备固定化酶。将固定化葡萄糖异构酶或含酶细胞装入柱形反应器,使经过纯化精制的10-30??萄糖溶液以一定流速流过固定化酶柱反应器,在反应温度60-80℃下,控制其它条件,完成葡萄糖异构化,流出反应器的反应液经过脱盐和脱色,浓缩,得到高果糖糖浆。目前一般的固定化葡萄糖异构酶的生产能力可到达1公斤固定化酶生产3吨高果糖糖浆,高活性的固定化酶可以生产6-8吨高果糖糖浆。
利用这样的固定化酶工艺生产大量的高果糖糖浆,满足了国内外市场的需求。这种技术为将淀粉转化为与蔗糖类似甜度和性质的糖,开辟新糖源,推动食品工业的发展作出了重要贡献。
由以上简单的介绍我们可以看出,酶和细胞的固定化是酶工程的重要组成部分,它的发展为酶的广泛应用,开辟新的应用领域,为实现酶催化的反应过程的连续化和自动化奠定了基础。
10)为什么酶具有催化活性?
要回答这个问题,首先应当回答什么是酶,说起来十分简单,酶是具有加快化学反应能力的蛋白质,也就是一种催化剂。我们知道,蛋白质是由多种氨基酸按一定的排列顺序组成,它如同一条很长的线,弯曲,折叠形成一个比较松散的‘线团’,这个线团并不是杂乱无章的,每一种酶蛋白的‘线团’都是按照一定的规则形成。因此,同一种酶蛋白都具有相同的结构和固定的形态。就是由于这种独特的结构,在‘线团’的‘空隙’部位,组成蛋白链的某些氨基酸固定在特定的空间位置上,构成具有催化能力的活性中心。而蛋白质链之间的相互作用,和大量的水分子结合在‘线团’的周围,使‘线团’中的‘线段’固定了位置和走向,也使活性中心固定下来。
活性中心通常是由三个氨基酸残基构成,因为不同氨基酸残基有的带有氨基、亚氨基、羟基、巯基、羧基等,具有酸碱催化和氢离子、或电子转移能力,从而是之具有有了催化能力。
酶的这种‘线团’结构,只有在正常条件下才是稳定的,一旦周围环境条件发生变化,或其它因素的影响,这个‘线团’就可能被打乱,乱了套的酶蛋白是活性中心的氨基酸位置发生改变,催化能力也随之丧失,这种现象称为失活。一般来说,高温,强酸,强碱,强烈的搅拌和有机溶剂都会使酶蛋白发生变性而失去活性。
11)酶是怎样生产的?
为了实现利用酶水解淀粉生产葡萄糖的目的,科学家从土壤,水和空气中分离了各种各样的微生物,从中挑选出能够大量产生淀粉酶和葡萄糖淀粉酶的微生物菌种,通过大量的研究工作,搞清楚菌种产生酶的各种条件和酶的性质,才可能进行大规模工业生产和应用。
在工业上,为了生产我们所需要的酶,大多数是在含有营养物的液体培养基中,于适当的条件下进行培养,让微生物菌种生长,并产生我们所需要的酶,这就是发酵。用于进行微生物发酵的容器通常称为发酵罐。在工业酶的生产中,大多数使用20-50立方米大小的发酵罐。
为了生产一种酶,不是任何一种微生物都可以使用,只有具有高产能力,经过长期的严格选择和研究的微生物才能使用。所以发酵必需使用‘纯种’。如果发酵时其它微生物进入了发酵罐,也会迅速生长,在发酵工业上称为‘污染’,轻的使酶产量大幅度下降,严重的将一无所获,使生产失败。一旦发生污染,其损失非常大。所以,发酵工业的无污染控制就非常非常重要。
为了保障无污染,首先在发酵之前需要对全套设备和发酵培养基进行蒸汽加热消毒,将存在的所有微生物全部杀死。发酵使用的空气也要通过严格的过滤除菌系统,确保进入发酵罐的空气没有微生物。为了保障微生物生长及产酶所需要的条件,如温度,氧气,培养基酸碱度和营养,发酵罐安装有各种附带的管道、阀门、搅拌、测定温度、溶解氧、酸碱度等的传感器和控制元件,现代的发酵罐可以通过计算机对发酵过程的各种参数和条件进行控制。为了使发酵均匀,增加通入的无菌空气在培养基中的溶解速度,增加培养基中的氧浓度,需要进行搅拌。发酵罐体一般是双层的,在罐内还装有螺旋状的管子,用于通入蒸汽加热,对设备和培养基进行消毒;或通入热水进行加热保温,维持发酵温度;另外发酵旺盛时会产生热量,使温度升高,也可以通入冷水进行冷却控制温度。各种传感器可以随时检测发酵过程的温度,酸碱度,溶解氧,通入的空气流量和压力,罐内的压力,搅拌的转速等,并将检测到的信息输入计算机,计算机根据科学家预先研究而设定的控制程序对发酵过程的各种参数进行控制,使发酵过程处于最佳状态,达到高产的目的。
在工业上,用于生产淀粉酶的微生物叫做枯草芽孢杆菌,它是一种细菌;用于生产葡萄糖淀粉酶的叫做黑曲霉,是一种真菌。它们产生的酶都不在细胞内,而是释放在发酵液中。所以发酵结束,可以将微生物细胞通过过滤或其它方法除去,得到含有酶的发酵液。由于发酵液中的酶浓度很低,需要进行浓缩。对于一般的酶来说,由于它们非常娇嫩,温度高时会使酶失去活性,不能使用加热蒸发浓缩的方法。但是因为淀粉酶和葡萄糖淀粉酶具有较好的耐热性,可以在高度真空的条件下,进行薄膜蒸发浓缩。因为酶液在蒸发器的表面上形成快速流动的薄膜,使酶液在蒸发器内只停留一两秒的时间,又因真空度高,水的沸点可以降低到50-60℃,不会造成大量酶的失活。现在在工业上使用超滤技术进行浓缩越来越普遍,超滤是一种膜分离技术,膜上具有微小的孔,孔的大小可以使小分子的水通过,而大分子的酶却不能通过。利用超滤膜的这种性质,使稀的酶液快速流过超滤膜表面,水从膜孔流过膜,酶被截留下来,可以很方便地浓缩酶液。这种方法不会有明显地温度变化,不会引起酶的失活,浓缩的酶收率高。浓缩的酶液可以直接使用,也可以制成干粉。最经常使用的方法是将硫酸铵,或酒精加到浓缩的酶液中,酶会因为溶解度减少从酶液中沉淀下来,通过过滤得到沉淀物,经干燥获得固体的酶制剂。也可以使用喷雾的方法,将酶溶液喷在高速流动的热空气中形成雾状液滴,由于液滴很小,在热空气中水分很快蒸发,留下固体的酶,达到干燥目的。由于热空气的高速流动,雾状液滴在热空气中的停留时间极短,酶受热时间很短,一般不会失去活性。
法生产葡萄糖的成本要比酸法低的多,在工业上获得广泛应用。
12)使酶变成水不溶性的又会怎样?
酶因为是蛋白质,很容易溶解在水中,又十分娇气,不稳定,在普通条件下会逐渐失去活性。在使用时,因为它溶解在水中,即使反应完了时大部分还没有失活,因为和反应产物混合在一起,很难分离出来,不能回收再次使用,而且也容易污染产品。利用酶催化反应生产产品时,只能是‘一锅一锅’的按批次方式进行。花费很大的力量生产的酶使用一次就抛弃了,十分浪费。这种方式也很难实现连续化、自动化生产。
虽然各种生物细胞中70?¥上是水,但酶在细胞内并不都是溶解在水中,而是结合在细胞内的特定部位上,是以一种‘固定化’形式存在,并能够高效率的催化各种反应。所以人们就想到,利用人工的方法,将酶‘固定’在水不溶解的固体材料上,制备成固定化酶。这样反应结束后可以很容易地将酶从反应液中捞出来,再用于下一次的反应。也可以把固定化酶装在一个圆筒形的柱状容器内,做成固定化酶反应器,使底物(反应物)溶液从一端流入 ,在柱内反应,控制一定的流速,使反应物在反应器内停留足够长的时间,进行充分反应,产生的产物从柱的另一端流出。这样可以不断地连续地进行生产,也容易实现自动化控制,达到较高的生产水平。
所谓的固定化,就是将酶或含有酶的细胞利用化学方法或吸附的方法,也可以使用象棉花夹带沙子那样的方法(在技术上称为包埋法),或者装在微型的半透膜形成的胶囊中的方法使它们成为不溶于水的颗粒。固定化后酶的稳定性可以大幅度地提高,耐受周围环境变化的能力得到改善,并能保持它的催化性能,更便于使用,为工业应用带来许多好处。
13)细嚼慢咽给人们的启迪
我们每天都要吃饭,你在吃馒头和米饭时,觉得有甜味吗?如果你吃饭时狼吞虎咽,你就不会感觉到,只有细嚼慢咽才会感觉到,咀嚼时间越长饭越甜。这是为什么?实际上,在馒头和米饭中含有大量的淀粉,它虽然是由葡萄糖组成的,但因为分子太大,没有甜味。吃饭时一面咀嚼,一面与口腔分泌的大量唾液混合。在唾液中含有一种淀粉酶,它能够使部分淀粉分解成由两个葡萄糖组成的有甜味的麦芽糖,就是我们经常吃的关东糖的主要成份。所以细细咀嚼的饭不仅能够感觉甜味,而且有助于消化。事实上食物的消化也就是从口腔咀嚼和与唾液混合开始,食物进入胃以后,淀粉在唾液淀粉酶和胃中的其它能够分解淀粉的酶的共同作用下,最后分解为葡萄糖,才能够为人体吸收。
在自然界不仅我们人类具有分泌分解淀粉的酶的能力,其它动物、植物和微生物也能分泌这些酶。因为这些生物也需要将食物中的淀粉分解成葡萄糖,供它的生命活动的需要;微生物能够分泌许多种分解淀粉的酶,一种是从淀粉分子链中间分解,形成由几个葡萄糖组成的寡糖的淀粉酶,另一种是从寡糖一端开始将葡萄糖一个一个的分解下来的葡萄糖淀粉酶。它们在分解淀粉时,就象合作十分密切的两个人,一个首先将长链淀粉剪成短的,另一个接着将短链分解为葡萄糖。微生物依靠分泌到周围环境中的这两种酶,将环境中的淀粉分解为葡萄糖,供给微生物自身的需要。我们人类就是利用微生物的这两种酶,在工业上大规模生产葡萄糖。
我们知道葡萄糖不仅在食品、饮料中广泛使用,在医院也是抢救病人,给病人增加营养,改善体质的药物。葡萄糖的更大的应用是在抗生素、味精、氨基酸、维生素C、有机酸,乙醇、丙酮等的工业生产中作为原料。全世界每年需要葡萄糖要几千万吨。所以葡萄糖的生产是许多工业的基础。
14)生产葡萄糖有两种方法,你认为那一种好?
在60年代以前,葡萄糖的大规模工业生产是利用盐酸在100℃以上的温度下水解淀粉进行生产的。因为需要的温度超过100℃,就要求用于酸水解的反应器必需密封,才能够使压力达到一个大气压以上,使温度超过100℃;盐酸是种酸性很强的酸,有很强的腐蚀作用,这就要求生产中使用的容器能够耐受高的压力、耐酸腐蚀;另外酸水解淀粉时会产生大量的颜色很深的杂质,要得到白色合格的葡萄糖,必需在生产中使用活性炭进行多次脱色,经过离子交换脱去盐,在脱色和脱盐过程中会带走一部分葡萄糖,造成产品损失。这些缺点促使人们去寻找新的葡萄糖生产方法。
60年代以后,利用淀粉酶和葡萄糖淀粉酶水解淀粉生产葡萄糖实现了工业化,首先要将淀粉制备成30??淀粉糊,加入少量的淀粉酶溶液,与淀粉糊混合均匀,在温度90℃左右进行反应,将淀粉分子链切割成短链的糊精或寡糖,这一步叫做‘液化’。将温度降低到60℃,再加入葡萄糖淀粉酶溶液,混合均匀,保温进行水解反应,使寡糖水解成为葡萄糖。当水解反应完成后,加热使酶失活,然后加入活性炭把产生的少量有色物质吸附,脱去颜色。将糖液加热蒸发除去水分,浓缩,葡萄糖就可以结晶出来,获得高质量的葡萄糖产品。
利用微生物产生的两个酶将淀粉水解成为葡萄糖与用盐酸水解完全不同,酶法是在近似于中性,常压和比较低的温度的条件下进行的,这个条件比较温和,不需要高温高压,也就不需要使用耐压抗腐蚀的设备,生产中消耗的煤和电也少;由于酶水解淀粉的条件温和,不会产生大量的有色物质,容易得到高质量的葡萄糖产品。由于这些原因,利用酶方法生产葡萄糖的成本要比酸法低的多,在工业上获得广泛应用。
15)把葡萄糖变的更甜
葡萄糖往往不作为食品或饮料的甜味剂来使用,因为它不够甜。现在可以通过酶工程方法将葡萄糖变成高果糖糖浆,其甜度与我们常吃的棉白糖差不多,不仅如此,由于它吸水性好,用它制造的糕点柔软、细腻、口感好,味道清甜。目前我国每年生产高果糖糖浆几万吨,主要用于糕点和饮料。
有一种微生物叫做放线菌,它能够产生葡萄糖异构酶,它的本事是将葡萄糖变成果糖。 为了生产高果糖糖浆,需要先将葡萄糖异构酶固定化,即将含有酶的放线菌细胞包在含水的胶状颗粒中,或结合在固体颗粒上制成固定化细胞或固定化酶,装在柱型反应器中,使葡萄糖溶液连续通过固定化细胞或固定化酶的酶反应器,流出的反应液中有42??葡萄糖转化为果糖,经过浓缩,制得的高果糖糖浆的甜度与蔗糖相当。这样就将甜度低的葡萄糖转化为甜度高的产品,扩大了应用范围。目前是将这一技术与葡萄糖生产技术联合,以淀粉为原料大量生产葡萄糖和高果糖糖浆,成为十分重要的高技术产业。
16)现在洗衣服离不开酶
这一点你可能不太相信,就让我来告诉你吧。衣服穿着时间长了就会赃,赃的原因可能是因为出汗,或长时间与身体接触;空气中落下的灰尘;也可能是因为吃食物或水果不小心,把饭菜和水果汁洒在衣服上,或者其它原因。这些所谓的赃东西主要是一些蛋白质,油脂灰尘和果胶等,它们混合后牢固地粘附在衣服的纤维上。如果只使用单一的洗衣粉并不能把它们彻底地洗涤下来。就象六、七十年代的洗衣粉那样,使用的量再大,衣服也洗不干净,白色衣服洗成了灰色,鲜亮的花色变成了灰暗色。如果你们不相信,可以问一问你们的爸爸妈妈或爷爷奶奶。
现在的洗衣粉却不一样了,使用的量不但大大减少,衣服也洗的干干净净,色彩鲜亮。这就是因为在洗衣粉中加入了酶。现在洗衣粉中加入的酶主要有碱性蛋白酶,脂肪酶,甚至有的还加入了纤维素酶,果胶酶等。它们的作用就是将赃物中的蛋白质、油腻、果汁等分解成能够溶解在水中简单物质,使灰尘不能够牢固地黏附在纤维上,在洗涤时的水流冲洗下脱离衣物。达到洗涤目的。
可是如果将酶直接加在洗衣粉中,那样是不行的。因为洗衣粉的碱性很强,洗衣粉的主要成分去污剂会很快将酶‘杀死’,造成酶失去活性,达不到分解赃物的目的。所以在研究和选择酶时首先要选择具有较好的耐受碱性和去污剂的酶,然后将酶‘包装’起来。
所谓的包装就是将酶制成颗粒,这种颗粒并不是简单颗粒,它是由6-7层组成。颗粒的核心是一个中性盐,如硫酸钠,氯化钠的小颗粒,外面以次包裹着包括酶的保护剂,助溶剂,稳定剂,酶,稳定剂,助溶剂,保护剂等多个层次,使酶被严密地保护起来,防止酶与洗衣粉的其它成分直接接触,造成酶的失活;又起到稳定化作用,保证酶在洗衣粉使用之前能够保持活性;同时还要保证在洗涤时,酶能够很快、很好地溶解,在洗衣服过程中充分发挥作用。这样的多层颗粒的制造需要采用特殊的技术和设备,将组成颗粒的各种组分利用喷雾的方法,在热气流吹动下,一层一层地喷涂在颗粒的核心上,形成多层颗粒。这样制备的洗衣粉用的颗粒酶保证了洗衣粉的高质量和洗涤效果。
17)酶也可以用于疾病的诊断
糖尿病是一种危害人类健康的比较常见的疾病,在人群中发病率为2-3??有的地区发病率达到7??属于胰岛素依赖型的糖尿病人,由于胰腺或胰岛发生病变,造成体内胰岛素水平低,致使食物中的淀粉消化产生的葡萄糖不能及时地转化成糖元储存在肝脏中,肌肉和其它器官的利用葡萄糖的能力下降,还会使脂肪和蛋白质转变为葡萄糖,使大量的葡萄糖存在于血液中,在通过肾脏时随着尿液排出。患有糖尿病的病人的尿液中葡萄糖含量高,感觉口渴,多尿,严重的会发生腿和脚浮肿,眼睛失明,肾衰竭,危及生命。
从糖尿病的诊断史上可以看出科学和技术的进步对医学的影响。在19世纪以前,诊断糖尿病没有办法,只能采取用嘴尝病人尿液的方法,因为糖尿病人的尿液中含有大量的葡萄糖,是甜味的。我们可以想象这种方法是多么不卫生和令人难以接受。后来随着有机化学的发展,出现了使用硫酸铜与尿液一起加热,如果尿液中含有葡萄糖会产生红色沉淀,这种方法只能检验有没有糖尿病,不能说明病有多重。以后又发展了能够检测葡萄糖量的化学定量方法,并一直延续使用到本世纪60年代。在方法上虽然有所改进,但是尿液中的其它物质有时会干扰测定的结果,使这些方法的正确性受到一定影响。
由于葡萄糖氧化酶的发现和利用微生物大量生产技术的成熟,使得测定尿液和血液中的葡萄糖方法发生了根本性的改变。葡萄糖氧化酶催化葡萄糖氧化,要消耗氧气,生成葡萄糖酸和过氧化氢(它是双氧水的主要成份),过氧化氢具有很强的氧化还原性能,能够使一些染料改变颜色。利用这种原理发展了葡萄糖氧化酶试剂盒,可以直接测定血液和尿液中的葡萄糖量。因为葡萄糖氧化酶只催化葡萄糖氧化,其它任何物质都不会影响和干扰测定,这一技术很快在糖尿病的临床检验上得到应用,它即快又准确。之后利用这个原理又开发了快速测定尿糖的试纸,只要将试纸在尿液中沾一下,一分钟以后试纸就会显色,与标准的带有不同颜色的色板进行比较,就可以知道尿液中葡萄糖的大概含量。这种直观、简便的方法为病人在家中自己检测创造了条件。
80年代,由于酶工程技术的发展,特别是生物传感器的发展,为临床检测提供了更加方便、快捷的技术手段。首先将葡萄糖氧化酶固定化在薄膜上,将制成的固定化葡萄糖氧化酶膜包裹在测定溶液酸碱度的pH电极上,放在含有葡萄糖的溶液中,葡萄糖氧化酶催化葡萄糖氧化,产生葡萄糖酸,pH电极表面的酸碱度发生改变,pH电极很快就可以测定到这种变化,由于产生的葡萄糖酸的量与葡萄糖浓度有关,测定到的pH变化的大小又与产生的葡萄糖酸量有关,因此,仪器很快就可以计算出溶液中葡萄糖的含量。也可以将酶膜覆盖在测定溶液中氧浓度的溶氧电极上,因为葡萄糖氧化时要消耗溶液中的氧,氧浓度的变化通过氧电极很快测定出来。由于氧的消耗量与葡萄糖的浓度有关,因此仪器可以容易地计算出葡萄糖的浓度。这样的测定方法更加快捷,简便,只要将酶电极放入要测试的溶液中,很快就可以从仪器上读出葡萄糖浓度或含量。
由于酶电极微型化技术的发展,酶电极可以做在注射针头上,配合电子线路和数字显示的微型化,可以使注射器具有测定血糖的功能,在注射器中吸入胰岛素后,在给糖尿病病人注射胰岛素时,就会测定出血糖的量,自动显示出应当给病人注射多少胰岛素,护士只需要根据注射器上显示的量注射,就可以完成给病人的治疗。使诊断和治疗一体化,保证了治疗的质量,又节省了时间。
随着半导体制造技术和微型化技术的进步,不久就可以实现监测、诊断、治疗一体化。利用半导体制造技术,可以将酶电极放在半导体的硅片控制线路上,同时与微型的注射、储存系统组合,构成一个具有血糖测定,又具有胰岛素注射和控制一体化的微型系统。它可以埋在糖尿病人的皮下,随时监测病人的血糖水平,一旦血糖高于正常人的水平,它会自动地向病人血液中注射适量的胰岛素,使病人的胰岛素和血液中的葡萄糖量保持正常。使糖尿病病人可以象正常人一样工作、生活。这样的监测、治疗一体化的微型系统可以工作很长时间,根据情况定期进行更换,不会给病人带来任何的不便和痛苦。
18)酶从水里‘爬’上了‘陆地’
从认识酶开始到80年代,在近一个世纪的时间里,人们一直认为酶只能在水中催化反应,有机溶剂只会造成酶的变性和失活。所以在教科书上和实验室里老师一再告诫学生,不要使酶与有机溶剂接触。现在的研究证明,这种传统观念需要加以适当的改变。
在研究能够催化脂肪(油脂)水解成甘油和脂肪酸的脂肪酶时发现,如果酶在干燥后放在与水完全不能混溶的有机溶剂,如正己烷和苯一类的烷烃和芳香烃中,可以将甘油和脂肪酸合成为脂肪。这也就是说,在水中脂肪酶可以催化脂肪的水解反应,而在有机溶剂中可以催化脂肪的合成反应。这一发现激起了人们的极大兴趣,并且惊呼酶从水里‘爬’上了‘陆地’。因为它就如同在泥盆纪水生动物爬上陆地成为陆生动物在生物进化中的意义一样,具有划时代的意义。因而成为酶工程的研究热点。
大量的研究证明,酶干燥后失去了大部分水,但是酶分子结构必需的水仍然会保留,它们被称为结构水,是酶具有催化活性必需的最低限量的水。这样干燥的酶在有机溶剂中的稳定性更好,可以耐受较高的温度,有的在90℃的条件下可以不失活,其催化活性有的要比在水中高几十倍。可见酶在有机溶剂中的表现完全不同于在水中的情况,这些特性为酶的新的应用奠定了基础。现在人们利用酶在有机溶剂中催化逆反应的特点,用于合成各种有机化合物,解决了许多化学合成难于解决的问题。
在这里介绍的只是酶工程的很小一部分,从中也可以看出酶工程涉及的范围非常广。可以预料随着进一步的深入研究,酶工程将具有更加广阔的美好前景。
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