中药双向发酵技术的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种中药双向发酵技术。具体步骤包括中药预处理，发酵菌种的选择及活化，最佳发酵方式的确定，通过发酵试验分析发酵产物有效活性成分变化，以此评估新型发酵炮制中药的药效。本发明利用中药及微生物所特有的药性及功能成分，通过二者的深层次相互作用提升其抗氧化、抗自由基、增强免疫力等医疗保健功能。
【专利说明】中药双向发酵技术
【技术领域】
[0001]本发明属于生物工程【技术领域】，涉及一种以中药为原料的微生物双向发酵技术。【背景技术】[0002]中药发酵技术是一种古老的传统中药加工技术，如传统发酵产品有淡豆鼓、百药煎、豆黄、六神曲、建神曲、半夏曲、沉香曲等。微生物发酵法是生物转化的方法之一，在中药领域中早有应用，可以提高中草药中活性成分的含量。目前，微生物发酵中药已成为中药研究的新内容，利用微生物中的酶系与中药中复杂的化学成分反应，可以改变某一成分含量或产生一些中药中不具有的洁性成分，达到改变药性、增强药效、降低毒副作用、增加适应性的目的，从而为中药有效化合物的筛选提供了新的途径。如《饮片新参》记载，半夏加姜计、矶水和豆饼发酵成〃半夏曲〃后，药性由〃温辛，有毒〃变成了 〃苦辛，平〃，其原有的猛烈的药力得到明显缓解。发酵对中药洁性成分的影响，可以从4个方面概括:(I)微生物在生长过程中产生生物洁性物质，包括多种酶、抗生素等。这些酶可以催化中药成分的分解，或转化成其他成分，如中药淡豆鼓，经过发酵过程，其皂昔类成分发生了变化，转化为游离的苷元，具有更强的生理洁性。(2)微生物的次生代谢过程中产生活性化合物。(3)中药所含的某些成分可以改变微生物的代谢途径，形成新的成分或改变各成分的相互比例。
(4)微生物的代谢可以将中药中的有效成分转化成新的化合物，同时微生物的次生代谢产物和中药中的成分发生反应，也能产生新的化合物。
[0003]但直到目前，对中药发酵的基础理论方面及加工工艺技术上的研究仍处于起步阶段，对单味药材发酵和传统复方发酵的深度开发非常有限，同时中药发酵技术也面临一些问题:安全性评估不充分、产品未标准化、功效成分不明确等。因此，对中药发酵关键技术的正确把握关系到中药产业发展方向和前景。
【发明内容】
[0004]中药双向发酵技术系采用不同的中药材为底物组成不同的药性基质，或在营养基质中加入具有洁性成分的中药材组成全性基质，或用两种以上中药材经交叉组合成为多样性(复方)基质，通过接种不同的菌种如药用真菌，使发酵的作用从原来单向性的、仅由农副产品构成的营养基质提供微生物大量生长菌体并产生各种代谢物质所需的C、N源等营养成分，发展到应用菌种的酶使药性基质的组织、成分分解、变化、产生新的成分，使发酵作用演变成双向性，从而形成新的性昧、功能不同的药性菌质或全性菌质，故具有双向性或多样性。再用此类菌质进行药理模型筛选后，可以获得不同的中药产品。就发酵产物的类型而言，有下列几种类型:(I)以菌种菌体为目的产物的菌体发酵；(2)以菌体代谢产物(初级和次级代谢产物)为目的产物发酵；(3)利用菌体细胞的一种或多种酶的修饰作用把一种
化合物如中药材中的某类大分子物质转变成结构相关的更有药用价值的其他化合物；
(4)以菌种的酶(含蛋白)为产物的酶发酵。本发明以中药为主要发酵基质，用菌种尤其是药用真菌进行双向发酵，以研究二者之间相互作用对抗氧化性的影响及其活性成分含量变化，
旨在探索出一种提高中药发酵度及其药效的技术和途径。本发明的目的是按如下技术方案实现的，其特征是它包括以下步骤:
(1)中药预处理(切片、磨粉、浸提等)；
(2)发酵种子液的制备(对选取的菌种进行扩大培养)；
(3)最适发酵培养基的确定(分别以单一中药、中药复合培养基为基础；对中药添加量、非药物部分含量如麦麸、玉米芯及料液比进行确定)；
(4)最佳发酵方式、条件的确定(固态、液态方式及最适温度、时间、通氧量、接种量、pH)；
(5)进行发酵试验动态跟踪分析发酵产物有效活性成分变化(总多糖、总黄酮、纤维素酶活性、HPLC测定发酵前后指纹图谱变化未确定新药效成分)，发酵最终产物的抗氧化活性(清除羟基自由基、过氧游离基、DPPH自由基试验)及免疫力(单核吞噬细胞如肝窦内表面的吞噬细胞KupfTer细胞的数目及吞噬能力)提升；
(6)根据以上所有结果来评估新型发酵炮制中药的药效。
[0005]本发明的有益效果
(I)工艺简单，设备要求不高，适于工业化推广。
[0006](2)利用中 药及微生物所特有的药性及功能成分，通过二者的深层次相互作用提升其抗氧化、抗自由基、增强免疫力等医疗保健功能。
[0007](3)促进中药产业升级和健康发展，为中药加工企业开发新产品提供一定的技术支撑和参考依据。
【具体实施方式】
[0008]下面的实施例可以进一步说明本发明，但不以任何方式限制本发明。
[0009]实施例1
液态双向发酵--称取干制大黄(Rheum officinale) 若干kg,通过粉碎机研磨
成粉末，然后加入8倍质量水溶液，搅拌并浸泡3小时；然后2000r/min离心15min，取上清液；以灵芝(Ganodorma Iucidum)为发酵药用真菌种子，PDA斜面培养基活化，采用玉米粉液体培养基扩大培养；通过在设定的基础培养基中加入30%浓度的大黄水提取液，制成全
性培养基(玉米芯:麦麸 1: 3，MgS04 (0.05% )、(NH4) 2S04 (0.2 % )、KH2P04(0.1% )均
为质量浓度)。接入灵芝种子液，置于在28 OC、摇床转速160r，自然ph条件下，培养7d;然后即可进行化学检测，测量灵芝的生物量及菌丝球直径。再对发酵液进行DPPH清除率、还原力及非特异性免疫能力测定；最后对发酵中药的药性做出评估。
[0010]实施例2
液态双向发酵称职干制黄芪(Radix Astragali)若干，通过粉碎机研磨成40目大小粉末，然后按1: 8的料液比加入水溶液，(即IOg黄芪粉末加入80mL纯水)，搅拌并浸泡I小时；然后1000r-3000r/min离心15min，取上清液；以灵芝为发酵药用真菌种子，PDA斜面培养基活化，采用玉米粉液体培养基扩大培养；通过在设定的基础培养基中加入30% (占培养基的全重量)浓度的黄瓦水提取液，制成全性培养基(玉米芯:麦麸=1: 3，MgSO4 (0.05% )、(NH4) 2S04 (0.2 % )、KH2PO4 (0.1% )均为质量浓度)。
[0011]接入灵芝种子液，置于在28V、摇床转速160r，培养7d ;然后即可进行化学检测，测量灵芝的生物量及菌丝球直径。再对发酵液进行苯酚硫酸法测定总多糖含量，络合一分光广度法测定总黄酣含量，PH计测定发酵液酸度，DPPH清除固态双向发酵称职干制黄芪若干，通过粉碎机研磨成40目大小粉末；以灵芝为发酵药用真菌种子，PDA斜面培养基活化，采用玉米粉液体培养基扩大培养；通过在设定的基础培养基中加入3% (占培养基的全重量)浓度的黄芪粉末 ，制成全性培养基(玉米芯:麦款=I: 3，MgSO4 (0.05%)、(NH4) 2S04 (0.2 % )、KH2PO4 (0.1% )均为质量浓度)。接入灵芝种子液，置于在28°C、通过机械通风来控制通氧量，自然Ph条件下，培养7d;然后即可进行化学检测，测量灵芝的生物量及菌丝球直径。再对发酵物进行苯酚一硫酸法测定总多糖含量，络合一分光广度法测定总黄酮含量，PH计测定发酵液酸度，DPPH清除率、还原力及非特异性免疫能力进行测定；最后对发酵中药的药性做出评估。
【权利要求】
1.中药双向发酵技术，其特征在于步骤如下: (1)中药预处理(切片、磨粉、浸提等)； (2)发酵种子液的制备(对选取的菌种进行扩大培养)； (3)最适发酵培养基的确定(分别以单一中药、中药复合培养基为基础；对中药添加量、非药物部分含量如麦麸、玉米芯及料液比进行确定)； (4)最佳发酵方式、条件的确定(固态、液态方式及最适温度、时间、通氧量、接种量、pH)； (5)进行发酵试验动态跟踪分析发酵产物有效活性成分变化(总多糖、总黄酮、纤维素酶活性、HPLC测定发酵前后指纹图谱变化来确定新药效成分)，发酵最终产物的抗氧化活性(消进基自由基、过氧游离基、DPPH自由基试验)及免疫力(单核吞噬细胞如肝窦内表面的吞噬细胞KupfTer细胞的数目及吞噬能力)提升； (6)根据以上所有结果来评估新型发酵炮制中药的药效。
【文档编号】A61K36/481GK103565944SQ201310581627
【公开日】2014年2月12日 申请日期:2013年11月20日 优先权日:2013年11月20日
【发明者】不公告发明人 申请人:青岛农业大学