编译：微科盟-三金，编辑：微科盟Emma、江舜尧。
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一些因急性COVID-19住院的患者会出现持续数月的呼吸道疾病。我们描绘了出院后3至6个月健康对照组和感染COVID-19后患者呼吸道和外周血中的免疫蛋白质组学情况。与健康个体相比，感染COVID-19后患者的呼吸道（但不是血浆）蛋白质组异常，与细胞凋亡、组织修复和上皮损伤相关的蛋白质浓度升高。呼吸道功能障碍较大的个体中观察到细胞毒性淋巴细胞数量增加，而B细胞数量增加和单核细胞亚群改变与更广泛的肺部异常相关。对一些COVID-19患者的一年随访表明，这些异常随着时间的推移而得到解决。总之，COVID-19会导致持续性肺病患者的呼吸道免疫环境发生长期变化，有证据表明细胞死亡和组织修复与细胞毒性T细胞的持续激活有关。
简述
许多从SARS-CoV-2急性感染中恢复的人在病毒清除后会出现数月至数年的长时间呼吸功能障碍。Vijayakumar、Boustani、Ogger、Papadaki等人的研究表明，感染后3-6个月出现持续症状的患者，其呼吸道免疫细胞格局发生了变化，并有证据表明会发生持续性的肺损伤。重要的是，不同的免疫细胞类型与正在发生的呼吸系统疾病的不同方面的严重性相关。
论文ID
实验设计
实验结果
1.呼吸道淋巴细胞数量增加是SARS-CoV-2康复患者的特征
我们招募了38名接受支气管镜检查的患者，以调查急性SARS-CoV-2感染（COVID-19）后3-6个月的持续性呼吸异常（图1）。所有患者在计算机断层扫描(CT)上都有持续的呼吸道症状和/或放射学肺部异常。同时获得外周血和支气管肺泡灌洗液（BAL）。根据急性COVID-19住院期间使用的呼吸支持水平，COVID-19队列被分层为中度（无/极少吸氧）、重度（无创通气）和非常重度（有创通气）。我们使用从COVID-19大流行前招募的29名健康志愿者获得的BAL液、血浆和历史流式细胞术分析作为对照。
我们通过流式细胞术比较了COVID-19患者与健康对照组(HC)的BAL液的细胞组成。与HC相比，COVID-19患者呼吸道中的细胞数量显著增加（图2A）。这种细胞数量的增加是由于呼吸道巨噬细胞(AM)、T细胞和B细胞的数量增加导致的（图2B）。CD56+CD3-（NK，自然杀伤细胞）和CD56+CD3+（NKT）细胞、CD14+单核细胞和嗜酸性粒细胞的水平与HC中的相似，而中性粒细胞水平降低（图2B）。呼吸道白细胞的比例与对照组相比，COVID-19患者的CD14+单核细胞和中性粒细胞减少。
未观察到急性COVID-19的严重程度与COVID-19 BAL的免疫细胞组成之间存在关联（图2B）。与急性COVID-19相关的外周淋巴细胞减少的症状相比，我们发现尽管NK和NKT细胞的比例降低，但在COVID-19患者队列中，外周T细胞、B细胞和CD14+单核细胞的减少的频率与HC相似。总之，这些数据表明，从严重的SARS-CoV-2感染中恢复后，外周血中的免疫细胞比率与一组年龄匹配的对照组相当。相比之下，呼吸道以残留淋巴细胞为标志的免疫图景仍然发生变化。
图1 呼吸道和血液样本分析技术示意图
示意图显示了从健康对照供体（2015-2019年COVID-19发生之前招募）和COVID-19患者收集的样本。如果在出院后3个月出现持续呼吸道症状并进行 CT和LFT，则招募该COVID-19康复患者进行本研究。有临床指征时进行支气管镜检（n=38）。在进行支气管镜检时获得用于后续分析的外周血。在住院期间和第一次随访时进行血液生物标志物检测。使用传统和光谱流式细胞术、Olink高通量蛋白质组学分析对来自健康对照和COVID-19患者（住院后3-6个月）的呼吸道 (BAL)和外周血(血浆)样本进行免疫细胞分析、蛋白质组分析和单变量蛋白质分析。免疫和蛋白质组数据与住院期间和首次随访期间的急性严重程度和血液生物标志物相结合。患者出院后随访12个月。当有临床指征时，在该时间点进行了支气管镜检查（n=3）。在这个时间点对呼吸道和外周血（血浆）样本进行免疫细胞和单变量蛋白质分析。LFT，肺功能检查；BAL，支气管肺泡灌洗液；CT，计算机断层扫描。
图2 出院后80天内，COVID-19 BAL中的免疫细胞分布发生了变化
(A) 左：来自健康对照组和COVID-19患者的BAL中的细胞总数。右图：来自感染COVID-19后患者的BAL中的细胞总数，根据急性疾病的严重程度进行分层。(B) 基于STAR方法和图1中所示的路线，来自健康对照和COVID-19患者的BAL中免疫群体的总细胞数(×106/mL)。(A和B)数据平均值表示为±SEM。健康对照，n=16；COVID-19患者，n=28，中度n=9，重度n=11，非常重度n=8。通过Mann-Whitney U检验或单向ANOVA+Tukey的多重比较检验检验了统计学显著性。∗p<0.05，∗∗p<0.01，∗∗∗p< 0.005。
2.COVID-19康复患者呼吸道血液未反映出蛋白质组学特征
随后我们评估了呼吸道和血液（血浆）蛋白质组，使用Olink平台检测了19 名COVID-19患者和9名HC的BAL和血浆中的435种独特蛋白。测量的蛋白质高度富集免疫炎症过程。BAL蛋白质组的主成分分析(PCA)揭示了COVID-19患者和HC之间的差异（图3A），其中病例和对照的分离沿PC1最为明显。在血浆中，PCA也显示出差异，在PC2中最为明显，尽管差异不如BAL显著。然而，在BAL和血浆中，COVID-19的空间位置和PCA图中的对照存在相当大的重叠，表明COVID-19患者的异质性，其中一些也显示出与HC相似的蛋白质组学特征。无监督层次聚类揭示了BAL中的两个主要聚类，一个主要由COVID-19样本组成，另一个主要由HC样本组成。相比之下，在血浆中没有可见的聚类结构，也没有明确区分病例和对照。这些分析表明，COVID-19的表型主要由呼吸道蛋白质组而非外周血反映。
COVID-19病例与HC的差异蛋白质丰度的比较分析确定了BAL中的22种蛋白浓度显著改变（5%错误发现率，FDR）（图3B和3C）。与HC相比，这些在COVID-19患者中均上调（图3C）。为了提供简洁和标准化的命名法，我们通过编码它们的基因的符号来报告蛋白。COVID-19和对照组之间差异最显著的蛋白质是甲状腺素结合球蛋白(SERPINA7)、二肽基肽酶4 (DPP4)、血浆丝氨酸蛋白酶抑制剂(SERPINA5)、激肽释放酶相关肽酶6(KLK6)、淋巴管内皮透明质酸受体1 (LYVE1)、双调蛋白(AREG)、因子3 (F3)、Fms相关酪氨酸激酶3配体 (FLT3LG)、谷氨酰胺肽环转移酶(QPCT)、金属蛋白酶3 (MMP3)和Proto 癌基因酪氨酸蛋白激酶Src(SRC) (图3C和3D)。使用STRING-db对22种上调蛋白的通路注释突出显示“白细胞活化”、“细胞死亡调节”、“对损伤的反应”和“对创伤的反应”。分析22种差异丰富的蛋白质与呼吸道免疫细胞比例之间的关系表明，中性粒细胞与AREG和低密度脂蛋白受体(LDLR)的相关性最强，而单核细胞比例与F3、FLT3LG、肌红蛋白(MB)和IL-1受体拮抗蛋白(IL1RN)(图3E)。尽管在COVID-19呼吸道中升高，但T细胞与差异丰富的蛋白仅表现出微弱的相关性。
与BAL的发现相反，在COVID-19患者与HC的血浆中未检测到蛋白浓度之间的显著差异。比较COVID-19 BAL液中上调的22种蛋白的估计log2倍变化与血浆中这些相同蛋白质的估计log2倍变化没有相关性，表明COVID-19康复患者呼吸道蛋白质组特征未反映在循环中。
435种蛋白的适度样本量和多重测试负担可能限制了检测差异丰富蛋白质的统计能力。为了检查蛋白质组数据中是否存在被差异丰度分析中的硬阈值隐藏的信号的证据，我们在没有蛋白质组差异的零假设下检查了预期p值分布的分位数-分位数(QQ)图病例和对照与观察到的p值。对于BAL和血浆，QQ图显示与对角线的显著偏差（尽管在BAL中更是如此），表明感染COVID-19后病例与血浆蛋白和BAL蛋白的HC之间存在系统差异。蛋白的p值分布不是均匀分布的且偏向零。这与BAL和血浆的PCA图上COVID-19样本和对照样本的分离一致。这些数据表明，与HC相比，COVID-19病例的BAL和血浆蛋白质组存在差异，但BAL的影响要强得多。
为了提高能力和研究潜在的蛋白之间的关系，我们使用了一种网络分析方法，加权共表达网络分析(WGCNA)，它利用蛋白之间的相关性来实现降维，从而减少多重测试负担。我们使用WGCNA来识别相关蛋白质的模块，然后测试这些蛋白质模块（由特征蛋白值定量表示）与病例/对照状态之间的关联。这在BAL中揭示了与病例/对照状态（5% FDR）显著相关的两个模块（“红色”和“蓝色”）。
红色模块由37种蛋白组成，其特征是与趋化性、炎症、细胞死亡和修复相关的蛋白。在COVID-19患者中，我们观察到相关红色模块蛋白组的共同上调，例如CXCR3趋化因子（CXCL9、CXCL10和CXCL11）和白细胞介素1A（IL1A）及其拮抗剂IL1RN。我们使用STRING-db来可视化模块中蛋白之间的已知或预测关系。为了以数据驱动的方式突出红色和蓝色模块中假定的关键蛋白质，我们定义了枢纽蛋白：定义为在WGCNA定义的蛋白质组网络中高度互连的点。这确定了红色模块中的caspase-3(CASP3)、上皮细胞粘附分子(EPCAM)、F3和MB。 F3和MB是一种与肌肉损伤有关的氧结合与释放蛋白，在单变量差异丰度分析中上调（图3B和3C）。CASP3参与细胞死亡，EPCAM和keratin-19(KRT19)指示BAL内的上皮细胞碎片，转化生长因子A (TGFA)是参与上皮修复的EGFR配体。因此，红色模块中CASP3、EPCAM、KRT19和TGFA的存在表明COVID-19呼吸道的关键特征之一是存在持续的上皮损伤和修复。
与HC BAL相比，蓝色模块蛋白在COVID-19主要上调。蓝色模块比红色模块大，包含108种涉及广泛生物活动的蛋白质。一些成员参与了细胞粘附和免疫细胞信号传导。蓝色模块中的中枢蛋白是补体成分C1q受体(CD93)、软骨寡聚基质蛋白(COMP)、胰岛素样生长因子结合蛋白3 (IGFBP3)、白细胞介素-1-受体2型(IL1R2)、LYVE1、MMP2（72 kDa IV型胶原酶）、神经细胞粘附分子1 (NCAM1)、L-选择素(SELL)、酪氨酸蛋白激酶受体Tie-1(TIE1)、肌腱蛋-X(TNXB) 和Vasorin (VASN)。其中，差异丰度分析中也鉴定出LYVE1和VASN。
与BAL网络分析相比，血浆中没有蛋白模块与病例对照状态相关。这表明持续的COVID-19呼吸异常在BAL中具有明显的蛋白质组学特征，与HC不同。相比之下，即使WGCNA方法提供了增强的统计能力，我们也无法检测到COVID-19患者血浆蛋白质组的变化。
在COVID-19病例中，初始感染的严重程度与BAL液中的蛋白之间没有显著关联，与我们的流式细胞术结果相同。因此，COVID-19呼吸道的免疫蛋白质组学特征似乎与急性疾病的严重程度无关。
图3 COVID-19呼吸道中存在独特蛋白质组
在COVID-19患者(n=19)和健康对照(n=9)中使用Olink免疫测定法测量了BAL和血浆中的436种蛋白质。(A)BAL和血浆蛋白质组的主成分分析(PCA)：每个点代表一个样本。(B)左图：热图显示了22种蛋白的Z分数归一化蛋白质丰度，这些蛋白质在COVID-19与BAL中的健康对照之间存在显著差异(5% FDR)。样本已按病例控制状态排序，然后按急性COVID-19感染期间的严重程度排序。蛋白通过层次聚类排序。右图：血浆中这22种蛋白质的热图，显示顺序与BAL相同。(C)火山图显示BAL中COVID-19患者和健康对照之间的差异蛋白质丰度分析。显示了标称-log10 p值。显著差异丰富的蛋白(5% FDR)以红色着色并标记。(D)COVID-19患者和健康对照之间5种最显著差异丰度蛋白质的BAL和血浆归一化蛋白质丰度(NPX)表达。PBH，Benjamini-Hochberg调整p值。(E)BAL中22种差异丰富的蛋白（来自COVID-19与HC的分析）与免疫细胞频率之间的相关性。
3.CXCR3配体和上皮损伤标志物与呼吸道T细胞和单核细胞反应相关
鉴于COVID-19患者呼吸道表现出蛋白质组异常以及T、B和NK细胞升高，我们接下来试图确定哪些BAL蛋白与特定免疫细胞群相关，并确定了几个重要的关联（5% FDR）（图4 A）。呼吸道中单核细胞的比例与一系列呼吸道蛋白显著相关，包括CCR7配体CCL19、CXCR3配体CXCL9和CXCL11、TRAIL（TNFSF10）和BAFF（TNFSF13B）（图4A）。CXCL11还与淋巴细胞和T细胞频率呈正相关，与AM频率呈负相关（图4A）。T细胞频率与SH2D1A（SLAM 相关蛋白）呈正相关。B、NK和NKT细胞与任何蛋白均无显著相关性。
除了显示与呼吸道中免疫细胞频率的相关性外，趋化因子CXCL9、CXCL10 和CXCL11及其受体CXCR3都是以COVID-19呼吸道为特征的红色WGCNA模块的成员。鉴于它们共享信号通路，我们通过计算综合评分（反映每种趋化因子相对于HC BAL中发现的中值浓度的平均倍数变化）并测试其与BAL免疫细胞频率关联，进一步分析了这些趋化因子的贡献。该CXCR3趋化因子评分与呼吸道T细胞频率(r=0.68, p=0.0001)和呼吸道NK细胞 (r=0.62, p=0.001) 密切相关。相反，与呼吸道NKT细胞没有显著相关性(p = 0.16) (图4B)。在COVID-19的数据集中（因为用于HC的历史流量数据中不存在CD16），总单核细胞频率也与CXCR3趋化因子评分相关（r=0.57，p=0.016）（图4C）。中间(CD14+CD16+) 单核细胞与CXCR3配体呈正相关，而CD14+单核细胞呈负相关，而CD16+单核细胞则无相关性 (图4C)。呼吸道中的T细胞比例与BAL中CD8a蛋白的浓度密切相关，但与CD4无关（图4D），这表明呼吸道T细胞的增加很可能是CD8+ T细胞比率增加的结果。
我们接下来确定了T细胞比率与红色模块的其他蛋白成员之间的关系，特别是那些表明正在进行的上皮损伤的蛋白成员。CD8a与CASP3和EPCAM的浓度密切相关，同时伴随着两种差异表达的蛋白质：MB和DPP4（图4E）。总之，这些数据表明与T细胞募集相关的蛋白，尤其是细胞毒性T细胞，与持续上皮损伤并在COVID-19呼吸道中上调的蛋白密切相关。
为了进一步评估这一点，我们通过细胞计数免疫测定在HC（n=29）和COVID-19患者（n=38）的扩展队列中测量了BAL CXCL9、CXCL 10和CXCL 11，包括那些样本生成Olink数据和其他样本。对这一更大样本集的分析显示，与HC BAL相比，CXCL10和CXCL11在COVID-19 BAL中显著上调（图4F），而没有CXCL9。我们还通过测量DPP4和Olink未分析的两个损伤标志物、白蛋白和乳酸脱氢酶(LDH)来证实COVID-19呼吸道损伤增加（图4G）。与HC相比，COVID-19患者的呼吸道中DPP4、白蛋白和LDH显著上调，验证了Olink的观察结果，并证实了先前因COVID-19住院的患者的呼吸道存在持续损伤。
图4 CXCR3配体和上皮损伤标志物与呼吸道中CD8 T细胞数量相关
COVID-19感染后BAL免疫细胞和蛋白浓度分析。(A)显示蛋白和免疫细胞频率之间关系的热图。显示的蛋白和免疫细胞特征是具有至少一个来自线性回归分析的显著（5% FDR）关联。(B和C)对于每个样本，CXCL9、CXCL 10和CXCL 11的蛋白浓度被标准化为健康对照的中值浓度。对于每个样品，计算3种蛋白的归一化值的平均值，以提供CXCR3趋化因子的汇总度量。然后将其与(B)COVID-19患者和健康对照中的T、NK和NKT比例以及(C)仅在COVID-19患者中的单核细胞频率和亚群。(D) Olink测量的BAL T细胞比率与CD4和CD8a浓度的关系。(E) CD8a浓度与呼吸道中CASP3、EPCAM、MB和DPP4的关系。(F) BAL中，使用legendplex测量CXCL9、CXCL10和CXCL11的浓度。(G)通过ELISA测定的BAL中DPP4、白蛋白和LDH的浓度。数据表示为中位数± IQR。(A)n=19名COVID-19患者的Pearsons相关性，显示了r值。（B-E）每个点代表一个个体患者，描绘了线性回归线±95%置信区间，并说明了Pearsons相关性的r和p值。（F和G）代表n=38名COVID-19和n=20名健康对照个体。使用Mann-Whitney U检验进行统计。∗p<0.05, ∗∗p<0.01, ∗∗∗p<0.005, ∗∗∗∗p<0.001。
4.不同的呼吸道免疫群体与COVID-19病理生理学的不同方面相关
COVID-19持续呼吸道症状的原因及其与免疫反应局部变化的关系，对于理解和治疗COVID-19呼吸道疾病至关重要。因此，我们评估了在支气管镜检查前不久采取的免疫反应与呼吸健康临床测量之间的关系。呼吸健康通过影像学(CT)和肺功能测试进行评估，包括用力呼气量（FEV1，一个人在1秒内可以从肺部排出的空气量）、用力肺活量（FVC，一个人可以从他们的肺部呼出的空气总量）和通过一氧化碳（TLCO）的吸收衡量的肺部的气体传输能力。除了FEV1和FVC肺功能和CT成像的相关性通常很差，它们的共同关系表明其密切相关。特别是CT异常程度与呼吸道功能降低（FEV1或FVC）和气体转移（TLCO）的相关性非常微弱（图5A）。
为了确定COVID-19呼吸功能的这种异质性是否与呼吸道中不同的免疫细胞表型存在差异相关性，我们利用高参数光谱反卷积细胞术分析了BAL免疫细胞上33种标志物的表达。使用FlowSOM与手动门控并行进行淋巴细胞和骨髓细胞的无偏聚类表明，这种方法可以识别大多数预期的免疫细胞群和亚群，而没有具有意外标记表达模式的细胞簇表明COVID-19呼吸道不具有大量独特的免疫细胞类型。BAL中组织驻留免疫细胞的富集和血液中的早期淋巴细胞群手动筛选支持了这一点。BAL中免疫细胞及其亚群的比例显示，没有一种免疫细胞类型主要与COVID-19的呼吸病理生理学相关（图5A）。相反，不同的免疫细胞群与不同的疾病指标相关。中性粒细胞、CD14+CD16+中间单核细胞和IgD-CD27+ 记忆B细胞与CT异常增加的相关性最强。同时，预测的FEV1或FVC的降低与淋巴细胞的相关性更强，其中NKT、B和活化的CD8 T细胞与这些呼吸道功能测量的相关性最强。在多个测试中应用5% FDR截止后，这些相关性并不显著。然而，使用BAL细胞数量的类似分析表明，这些特定的免疫和临床特征与5% FDR截止值显著相关。
基于临床测量分离队列支持了不同BAL生物标志物和免疫细胞群的增加与不同临床特征相关的观察结果。与变化更有限的个体相比，CT异常增加的个体的BAL DPP4、LDH和白蛋白浓度没有差异（图5B）。在FVC降低的个体中，白蛋白和LDH（但不是DPP4）增加，而在TCLO降低的个体中，DPP4（而不是白蛋白和LDH）增加（图5B）。BAL中性粒细胞升高与CT、FVC和TLCO 中更严重的异常相关（图5C）。BAL B细胞在CT异常增强或FVC降低但TCLO 不增加的个体中增加（图5C）。CT异常增加的患者NK细胞增加（图5C）。呼吸道中的总骨髓细胞与呼吸系统疾病的任何特定测量无关。然而，在CT异常比例较高的个体中，中间CD16+CD14+单核细胞增加，而非典型的CD16+单核细胞在FVC降低的个体中增加（图5D）。伴随BAL中性粒细胞增多，与HC BAL相比，COVID-19 BAL中主要的中性粒细胞趋化因子CXCL8增加，并且CXCL8浓度与呼吸道中性粒细胞显著相关（图5E）。同样，CCL2在COVID-19 BAL中显著增加，并且与BAL单核细胞数量密切相关（图5G）。CXCL8或CCL2未与 CT、FVC或TLCO恶化分离（图5G和5H）。
总之，这些数据突出了测量呼吸系统疾病不同病理生理方面的临床评估，并与不同的免疫学成分相关联。CT异常特别与粒细胞和单核细胞受累有关，其存在与趋化因子的典型招募有关。
图5 不同的呼吸道蛋白质组学和免疫细胞表型与COVID-19呼吸道病理学的不同指标相关
(A)BAL中的免疫细胞比例占总白细胞的百分比，BAL白蛋白(μg/mL)、LDH(OD450)和DPP4(ng/mL)与CT(异常百分比)或FEV1、FVC、TLCO（预测正常值的百分比）。Spearman的rho显示为热图。(B)BAL中的白蛋白(μg/mL)、LDH (OD450)和DPP4(ng/mL)按CT异常(%)、预测的FVC (%)和预测的TLCO (%)分离。(C)每毫升BAL与CT异常、FVC和TLCO的主要免疫细胞群数量。(D)每毫升BAL的单核细胞亚群总数由CT、FVC和TCLO分离。(E)Legendplex在HC和COVID-19患者中测量的BAL CXCL8 (pg/mL)，并与中性粒细胞总数(每mL/BAL)相关。(F)通过legendplex在COVID-19患者中测量的BAL CXCL8 (pg/mL)，按CT异常(%)、预测的FVC (%)和预测的TLCO (%)分隔。(G)在HC和COVID-19患者中由legendplex测量的BAL CCL2(pg/mL)，并与BAL中的骨髓细胞(CD11b+)相关。(H)Legendplex在COVID-19患者中测量的BAL CCL2(pg/mL)，按CT(%)异常、预测的FVC (%)和预测的TLCO(%)分隔。在适用的个别点显示，数据表示为中位数±IQR。每个点代表一个单独的患者。通过Mann-Whitney U检验(B-H)的统计显著性。Benjamini-Hochberg调整(5% FDR) p值∗p<0.05,∗∗∗p<0.01,∗∗∗p<0.005,∗∗∗∗p<0.001。Pearson的相关性在（E和G）中进行，显示了r和p值，以及最佳拟合线±95%置信区间。
5.BAL T细胞和B细胞与COVID-19持续的呼吸道疾病表现出离散关系
接下来，我们进一步与三种生物标志物DPP4（COVID-19 BAL中差异调节最大的蛋白质）、LDH和白蛋白作为呼吸道持续损伤的标志物进行了关联。LDH活性与预测的FEV1和FVC呈负相关，并与BAL中各种CD8 T细胞亚群的比例密切相关，白蛋白显示出相似但较弱的联系（图6A）。相反，DPP4与CT异常增加和TCLO减少相关，但与BAL中T细胞的比例呈负相关。相反，B细胞的比例，特别是记忆B细胞，是分析显示唯一与DPP4浓度密切相关的免疫细胞（图6A）。
B和T细胞可以在急性COVID-19期间的保护性和病理性免疫反应中发挥关键作用，并且与HC相比，在COVID-19个体的BAL中显著升高（图2B）。与呼吸功能和病理生理学临床测量的相关性表明，T细胞与呼吸道疾病的关联性更强，表现为FEV1和FVC减少，而B细胞，特别是记忆B细胞，似乎与所见的所有更严重的病理生理变化有关（图5A）。在FVC低于预测值90%的COVID-19患者中，BAL中CD69+ CD8 T和CD103+CD69+CD8 T细胞的数量显著增加（图6B和6C）。没有其他T细胞群或亚群在FVC降低个体中显示出显著性，但活化的CD4 T细胞存在类似的趋势（图6B和6C）。相反，对B细胞的分析显示，CT异常增加或FVC或TCLO减少的个体呼吸道中的记忆B细胞显著增加，而原始B细胞和浆母细胞没有差异（图6D）。
为了进一步检查B细胞在持续呼吸功能障碍中的作用，我们测量了抗体反应。虽然HC与COVID-19患者的BAL中的总IgA相似，但总IgG显著增加（图 6E）。尽管在疫苗接种前采集了样本，但COVID-19患者也可检测到针对SARS-CoV-2刺突蛋白受体结合域 (RBD) 的抗体，同时伴随BAL中IgA和IgG和血浆中的IgG（图6E）。COVID-19出现的总抗体或病毒特异性抗体浓度与BAL或全身发现的B细胞亚群比例的相关性极小（图6F）。相反，BAL病毒特异性IgG在FVC减少的个体中显著增加，但在CT异常增加或TLCO减少的个体中则没有（图6G）。与此一致，病毒特异性抗体与BAL中的CD4和CD8 T细胞密切相关（图6H）。与激活的（例如，PD1+ CXCR5-CD4和CD8）T细胞有特殊的相关性，而不是与B细胞辅助功能更典型相关的CXCR5+ PD1+ CD4和CD8 T细胞。
总之，这些数据表明T细胞频率升高，尤其是CD8+ Trm细胞，与COVID-19细胞死亡和持续呼吸道疾病的指标增加有关。同时，BAL中记忆B细胞的存在与DPP4增加（但不是LDH）和COVID-19的一系列病理生理结果有关。
图6 呼吸道T细胞和B细胞丰度增加与COVID-19更严重的持续呼吸病理生理学相关
(A) BAL中的免疫细胞比例，作为总白细胞的百分比，BAL白蛋白(μg/mL)、LDH (OD450)和DPP4 (ng/mL)与BAL白蛋白、LDH和DPP4浓度相关。(B和C) (B) BAL T细胞亚型和(C) CD4和CD8 T细胞亚群针对FVC进行分析。(D) 每毫升BAL的B细胞子集数由CT、FVC和TLCO分隔。(E) 在BAL和血浆中测量了总RBD特异性IgA和IgG。(F) 抗体浓度与总白细胞的BAL和浆B细胞亚群相关。(G) 用CT、FVC和TLCO分离的BAL和血浆中测量的抗体浓度。(H) 抗体浓度与BAL CD4和CD8 T细胞及其亚群在总白细胞中的比例相关。（A、F和H）Spearman相关性。在 Benjamini-Hochberg调整为5%的FDR 后，相关性p<0.05由粗框表示。（B-E和G）通过Mann-Whitney U进行测试。 Benjamini-Hochberg调整(5% FDR)，∗p<0.05, ∗∗p<0.01,∗∗∗p<0.005,∗∗∗∗p< 0.001。 (A、F和G)是显示Spearman的rho相关性。
6.COVID-19呼吸道免疫细胞浸润随时间下降
我们队列中的一个子集，最初于2020年春季感染了SARS-CoV-2，也在出院后1年进行了临床评估。与一项更大的研究一致，该研究包括在COVID-19没有临床适应症需要对放射学变化进行支气管镜检查的个体，与出院后1年肺内CT异常与出院后3-6个月相比显著减少（图7 A）。到出院后1年，患者预测的FVC和TLCO也有所改善（图7A）。
然而，COVID-19呼吸道疾病的改善程度存在一些差异，出院后1年检查的3名患者继续有实质性的肺部CT异常，因而有理由进行随访支气管镜检查。在初始支气管镜检查和1年随访支气管镜检查之间，所有三名患者的BAL细胞总数都大大减少，与HC呼吸道相当（图7B）。同样，T、B、NK和NKT细胞以及中性粒细胞和AM的数量减少到接近或在健康个体呼吸道中看到的正常范围内（图7B）。非典型单核细胞和中间单核细胞在出院后1年也减少，但典型单核细胞增加（图7B）。在两个淋巴细胞升高的个体中，CD4与CD8 T细胞的比例增加（图7C）。此外，CD8 T细胞的比例呈下降趋势，而CD4没有；尽管两个时间点之间Trm或活化(CD69+)表型的比例保持相似（图7D）。记忆B细胞比例在出院后3 至6个月和1年之间也下降（图7E），而浆母细胞没有。第一次支气管镜检查中浓度升高的两名患者的呼吸道DPP4浓度下降（图7F）符合渐进式恢复轨迹。然而，在第一次支气管镜检查时，所有3名患者的LDH均低至无法检测到，呈现增加趋势，而白蛋白浓度在两个时间点均未发生变化，但也在HC 范围内（图7F）。
总之，我们的研究结果显示了呼吸道免疫和蛋白质组学图景的持续变化。不同的免疫蛋白特征与COVID-19肺的不同病理生理变化有关。然而，这些变化和肺部病理学似乎在较长时间（>1年）内会消退。
图7 在COVID-19初次支气管镜检查1年后，呼吸道中观察到细胞结构减少
(A) 首次就诊和1年随访时的肺CT异常百分比或预测的FVC (%)或TLCO (%)（n=17 pCOVID-19患者）。(B) BAL中淋巴细胞群、巨噬细胞、中性粒细胞和单核细胞亚群的总细胞计数和细胞计数。(C和D) (C) T细胞亚群的比例和(D) CD4和CD8 CD69+ CD103+在BAL T细胞中的比例。(E) BAL中CD20+ B细胞的记忆(CD27+IgD-)和浆母细胞(CD27+CD38+)的比例。(F) BAL中的DPP4、LDH和白蛋白测量。所有数据都描述了出院后3-6个月和出院后1年的第一次支气管镜检查。每个点代表一个病人。(B-E)代表n=3名患者。绿色阴影表示在健康呼吸道中观察到的人口比例和介质浓度的中位数±IQR。(A) Wilcoxon配对符号秩检验。∗p<0.05，∗∗∗p<0.001。
讨论
从COVID-19中恢复可能会因长期症状而复杂化，包括呼吸困难。本文中我们研究了先前因COVID-19住院的患者在发现在急性感染数月后，呼吸道中持续存在蛋白质组学和免疫学异常，但外周血中没有异常。虽然患者之间存在很大的个体差异，但我们观察到与COVID-19呼吸道中持续的细胞死亡、上皮损伤和组织修复相关的蛋白质上调。这与激活的组织驻留CD8 T细胞数量增加有关。初步证据表明，从长远来看，这种改变的呼吸道图景确实有所改善，出院后1年呼吸道免疫细胞数量减少。
对SARS-CoV-2感染的急性反应的特点是循环蛋白广泛上调，包括IFN通路蛋白、趋化因子、细胞毒性蛋白和上皮损伤标志物。更严重的疾病与增加的炎症蛋白（例如，IL-6、TNF、GM-CSF、IL-1RN和IL-18）有关。在急性COVID-19期间，在呼吸道中可以看到类似的上调蛋白质模式，尤其是CXCL10等趋化因子和IL-6等细胞因子。然而，在SARS-CoV-2感染后3-6个月，尽管存在持续的呼吸道疾病，但在急性疾病期间差异表达的血浆蛋白似乎已恢复到与HC中相似的浓度。即使是WGCNA等数据降维方法也未能突出几个月后COVID-19感染与血浆蛋白质组之间的任何显著关联。
相比之下，COVID-19的呼吸道继续表现出异常的蛋白质组，与急性疾病中的呼吸道具有独特和共同的特征。与急性COVID-19相比，与炎症相关蛋白的特征不那么突出，而参与上皮损伤和修复的蛋白（例如，EGFR配体AREG和上皮标志物KRT19）的上调持续存在。调节ECM的MMP-3在COVID-19后呼吸道中也有差异上调。MMP3和AREG在小鼠体内感染甲型流感病毒(IAV)后，在体外在人成纤维细胞和上皮细胞中均上调，并且两者都与肺中的上皮修复和纤维化有关。
呼吸道中升高的LDH和白蛋白进一步证明了COVID-19持续的细胞死亡和对呼吸屏障完整性的损害。这一观察通过COVID-19 BAL中相关蛋白模块的上调得到加强，其个体成员反映上皮损伤（EPCAM、KRT19）、细胞死亡（CASP3）和上皮修复（TGFA），但也表明这些过程与免疫细胞募集和存活（CXCL9、CXCL10、CXCL11、IL-7）之间的联系。呼吸道内细胞死亡的增加与T细胞（主要是CD8 Trm细胞）的比率以及呼吸功能障碍的加剧有关。在严重急性呼吸道病毒感染的小鼠模型中，CD8 T细胞被认为是一把双刃剑。尽管它们释放的细胞毒性分子和细胞因子对于清除病毒至关重要，但它们也可能导致组织损伤和免疫病理学变化。虽然目前认为呼吸道中预先存在的病毒特异性CD8 Trm细胞可以防止再次遇到相同的病毒，但人们对它们在长期呼吸道病毒相关病理学中的作用事实上知之甚少，尤其是在人类中。这主要是由于在恢复期间没有收集到相关样本。我们的COVID-19数据支持这一概念，即在从急性疾病恢复后很长时间内，呼吸道中CD8 Trm细胞的持续激活会引起呼吸道上皮细胞的持续损伤，从而导致呼吸道疾病。
呼吸道中Trm细胞增殖的机制尚不清楚，尽管几项报告研究了感染后一年内肺组织中的病毒特异性CD8 T细胞。虽然病毒特异性CD4和CD8 T细胞在SARS-CoV-2感染后迅速扩增并形成Trm细胞，但这些细胞在急性疾病消退后迅速衰减，CD8 Trm细胞的下降速度比CD4 Trm细胞更快。然而，与未感染的肺相比，先前经历过IAV感染的小鼠的肺更能保持CD8 Trm细胞水平，这表明严重感染促进了pro-Trm生态位。这与我们的观察相符，即CD8 Trm细胞数量取决于蛋白质和呼吸道中的损伤程度，并且在同一个体中纵向变化，而CD4 Trm 细胞保持相对静止。许多因素可能导致COVID-19呼吸道中CD8 Trm生态位的异质性。首先，虽然我们所有的COVID-19样本均取自在支气管镜检查前通过qPCR检测为SARS-CoV-2阴性的患者，但在IAV等其他呼吸道感染数月后观察到持久性抗原，SARS-CoV-2抗原库可以推动持续的细胞毒活性和CD8 Trm细胞的维持。其次，肺内Trm细胞的持久性依赖于局部T细胞存活信号的可用性，例如IL-7和CXCR3配体。事实上，IL-7和CXCR3配体是维持在COVID-19呼吸道中的蛋白质网络的一部分。最后，有一些证据表明最近从COVID-19康复的一些患者出现了自身免疫。这些不同的机制可能共同作用于形成COVID-19呼吸道中的CD8 Trm细胞反应和其他免疫细胞，并观察到持续上皮损伤和呼吸功能障碍。
B细胞比率在肺部异常且气体交换减少的个体中更高。在急性感染期间或接种疫苗后，B细胞对于产生保护性病毒特异性抗体至关重要。在SARS-CoV-2感染后长达6个月的时间内，可以在肺部检测到病毒特异性B细胞，但仅代表人肺中存在的少数B细胞。呼吸系统疾病也会导致呼吸道和肺B细胞的比率增加，类似于COVID-19呼吸道，常见于包括COPD和间质性肺病(ILD)在内的一系列呼吸系统疾病。B细胞比率与病毒特异性抗体无关，后者与T细胞反应更紧密相关，这表明B细胞不依赖于共同的抗原特异性驱动因素。在患COVID-19后B细胞究竟如何促成持续的呼吸道病理学尚不清楚；它们可以产生促炎因子和调节因子。调节性B细胞功能的破坏已被证明与纤维化肺病有关。B细胞还可以通过诱导成纤维细胞的活化和迁移来促进组织修复。因此，在COVID-19呼吸道中，B细胞可能直接促进异常组织修复。
急性感染患者外周血中单核细胞和DC的功能受损以及呼吸道单核细胞群的过度活化，是急性COVID-19的特征。在我们的COVID-19患者中，外周血单核细胞已正常化，并且与肺功能障碍的标志物无关，但CT异常较大的患者BAL 中间单核细胞增加。在人类中，炎症性损伤后，单核细胞被募集到呼吸道以分化成新的AM。严重的病毒感染会导致AM储量的快速消耗，并且单核细胞的不同亚群对肺巨噬细胞的补充有不同的贡献。单核细胞向巨噬细胞的转变在慢性肺病中也更为明显，新产生的单核细胞衍生的巨噬细胞以促纤维化的方式发挥作用。因此，中间单核细胞的增加可能表明单核细胞分化为AMs的程度增加，与HCs相比，在COVID-19呼吸道中的数量增加。然后，该过程的放大可能有助于肺内的持续修复。
已有研究表明大多数COVID-19患者的放射学异常逐渐消退，而在我们的研究中，即使是三名持续呼吸异常的患者也表现出CT改善和呼吸道免疫细胞浸润减少。这符合SARS-CoV-2感染可导致组织性肺炎的假设，随后的变化反映了持续的上皮损伤和愈合的实质，而不是固定的纤维化。此外，在COVID-19持续呼吸道疾病中免疫反应的积极参与表明使用免疫调节治疗可以加速患者恢复。
原文链接：
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC8789571/
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