了解娃娃鱼性腺发育、产卵等过程及特点，其目的是为了掌握娃娃鱼人工繁殖技术，它是保护、增殖、合理利用资源的关键之所在，亦是扩大养殖规模的关键之一。
娃娃鱼的人工繁殖，其先决条件是必须要有成熟的亲体，再辅以外源性激素催产，才可能获得受精卵，受精卵再经过科学的方法孵化出幼体。否则，再好的催产技术也无济于事，因此，培育一定数量成熟的亲体，是人工繁殖的首要因子。
一、培育池和亲体的放养
（一）培育池
亲体池要依据娃娃鱼独特的生理特点进行建造，其目的是为了亲体的生长、发育和便于饲养管理，获得成熟的亲体，供人工繁殖。
培育池一般要建成封闭式的，各地可根据实际情况选择人防工程、地下室、山洞等地方建造。
若建造在人防工程、地下室、地道、山洞内，则只需要配备冲水设施，以便在亲体产前进行冲水，刺激性腺发育。
若建在室内，其培育池以椭圆形较好，池内安装多个进水管，进水管向一方倾斜，有利于形成流水，这其实也是一种生态催熟方法。
培育池每年要清洗和消毒，杀灭敌害细菌及一些水生动植物。
（二）亲体放养
亲体放养，要根据培育池条件及繁殖要求，以适当密度合理放养。
放养密度，以亲体个体大小而定，一般每平方米放养一尾为宜。
亲体放养及培育，要分级实行雌、雄体配组混养，也可单独进行雌、雄放养，催产前再进行配组放养，以便催产时使用，并按发育好坏，依次催产。
二、亲体培育
亲体培育要根据食性、不同季节食量的变化和性腺发育规律，进行科学饲养。其中心环节是控温、投饵、调节水质。
娃娃鱼性腺成熟特点为一年一次性腺发育成熟类型两栖大鲵，人工培育包括秋季培育、春季培育和产前培育。
经过十几年的研究，我们查明了制约娃娃鱼规模化繁殖的两种制约因素：一是娃娃鱼雌雄发育不同步；二是雄性娃娃鱼精子活力低。针对这些性腺发育生物学及繁殖生物学的难题，我们依据生殖生理学基础知识和发育生物学理论，运用中医学、中药学、中药药理学、分子生物学、中医男科学、中医内分泌学、中医内科学等相关学科原理，研制了中药生精汤和促卵泡汤，提高了雄性 娃娃鱼精子活力和加快雌性卵巢的发育成熟速度。
（一）秋季培育
秋季培育阶段，是娃娃鱼性腺退化吸收时期，人工繁殖后娃娃鱼体质虚弱，易感染疾病。故产后培育是使其迅速康复体质。这个季节培育，由于气温、水温都较高，亲体摄食率降低，故必须通过人工降温来改善亲体栖息环境温度，促进亲体摄食；亲体产后体弱，需要补充大量营养物质，这样必须投喂人工配合饲料或鲜活饵料，使其产后迅速恢复健康，加速精卵巢退化至Ⅱ期，同时积累脂肪准备越冬，为翌年性腺发育打下良好基础。
（二）春季培育
春季培育，是亲体生长和性腺发育的重要阶段，春季随着水温上升，亲体生长、发育、摄食日益旺盛，因此，各项饲养管理工作也要相应跟上。
春季培育主要是4、5两月份。每年4月初，水温上升到12℃以上，娃娃鱼机体新陈代谢旺盛，摄食量增加（图4－1）。
性腺开始向Ⅲ期发育，因此这一期间要增加投饵量。同时开始采用流水刺激性腺发育，每天冲水一次，每次冲水20分钟。
春季培育亲体的投饵要求：投喂人工配合饲料。我们根据娃娃鱼性腺发育与成熟的独特规律，研制成功了亲体专用配合饲料。其饲料中添加了补肾填精、活血化瘀、益气健脾的中药生精汤和促卵泡的中药制剂。
（三）产前培育
娃娃鱼产前培育是关键，它的好坏关系到亲体成熟率高低，影响到人工繁殖率。此期主要是6、7两月份。这一期间水温上升到19-23℃，亲体性腺发育加快，性腺成熟系数增大。需要摄取大量营养物质 来补充生长发育（性腺发育）所需要的物质。由此，可见6、7两个月培育中心任务是培育充足的浮游植物即原水生态中藻相、投饲、调节水质、冲水刺激。投饵主要投喂人工配合饲料，产前人工配合饲料还要添加适量的精氨酸、色氨酸。同时要添加中药生精汤和促卵泡汤以及新鲜泥鳅、鲫鱼、青蛙，这些饵料的活性物有利于娃娃鱼的性腺发育，这个季节的培育对生态环境要求更高，溶氧应5mg/L以上，有机物耗氧4mg/L以下，铵态氮、亚硝态氮要低于0.1mg/L（表4－1）。同时水质要求矿化程度好、硬度大。每天换水3次，换水量为全池的1/2，也可全池换水。每天要冲水3次，每次冲水30-50分钟，并且昼夜模拟自然生态环境的流水哗哗响的微流水声音，有利于刺激性腺发育成熟。产前培育则根据卵母细胞和精子形成的生理特点，投喂专用配合饲料，其中添加了中药制剂生精汤和促卵泡汤。为了扩大养殖规模，增殖娃娃鱼资源，提高娃娃鱼繁殖率，必须掌握娃娃鱼性腺发育规律，以便得到成熟的卵子和精子。因此，亲体培育要采用两种方法相结合进行培育，这就是生态学和生理学两种方法。
图4－1 娃娃鱼亲体月投饵率
生态学方法：创造近似于自然环境条件下娃娃鱼性腺发育的外界环境因子，因为娃娃鱼亲体在自然界，是在石灰岩地区的森林植被好的山溪泉水和阴河流水中的环境条件下发育成熟的（两个特点一是水中浮游植物生物量高及光照强度低下，二是水温始终保持16－22℃，这两个特点是影响娃娃鱼性成熟的主要因素）。故此人工建造流水、阴暗的亲体培育池并控制水温（18－21℃），是获得成熟的卵子和精子的关键因素。娃娃鱼亲体培育池如图4－2。
亲体培育生态环境条件的优劣是关系到其性腺是否成熟的重要因素。因此，建造良好的生态环境条件是亲体培育的重要措施。
表4－1 娃娃鱼亲体池水质状况
1、亲体培育池的独特结构
亲体培育池要依据娃娃鱼独特的生理特点及娃娃鱼对生态环境条件要求进行建造，其目的是有利于亲体性腺发育。
亲体培育池建造要求：循环式和椭圆形暗道流水式。池底暗道要间隔20～30厘米安装一个不锈钢出水管，管径为3～8厘米；出水管向同一方向倾斜，形成冒泉流水。池底要用小卵石铺成梅花状，小卵石间隔5～15厘米铺一个。池内要用大卵石（卵石长40厘米，宽30厘米）筑成穴洞。池上方要安装几个自动喷水管头（即喷雾头）。
2、水温
水温是娃娃鱼性腺发育的决定因素。水温的作用在于促进娃娃鱼摄食。水温每年在3～8月份要控制在18～24℃。这是培育成熟亲体的关键生态因素。因为娃娃鱼每年在3～8月份完成一个性腺发育周期。水温日变幅不要超过±1.5℃。如何将水温控制在18～24℃。这是养殖者要关注的问题。控制水温办法很多，各地要因地制宜，以降低成本为原则。间接控制法，如利用深井水、山溪冷泉水、人防工程内建造蓄水池的水。直接控制法就是用中央空调制冷。水温在3～8月份绝不要超过25℃。
3、光照
娃娃鱼有背光运动的习性，即畏旋光性。因此亲体培育其光照要控制在Lux100～2500的范围，这是培育亲体成熟的重要生态技术措施。通俗的说法就是在黑暗的光线下培育亲体。因此，亲体培育宜选择室内建池。当然在地下室、人防工程内建池更佳。若无这些条件，室外建池也可以，但必须设置遮荫棚，遮荫棚要全池覆盖。否则雌、雄娃娃鱼性腺发育很难成熟，从而就没有成熟亲体可供繁殖。
4、营养与饲料
营养丰富的饲料是娃娃鱼性腺发育的物质基础。亲体培育营养要求高，蛋白质含量在42～48%，糖含量10～18%，脂肪含量2～6%，维生素、矿物质含量1.5%，其它为10～15%。这说明娃娃鱼性腺发育过程中营养物质的质量龙为重要。
营养物质对亲鱼产卵量的影响有两种途径：一是“脑一脑垂体一性腺内分泌系统轴”；二是影响卵形成中的生化成分。
亲体在其性腺发育过程中母体需要从外界摄入大量的营养物质，特别是储备充足的蛋白质和脂肪，它是母体将其转化为卵黄脂磷蛋白的前身物。亲体长得肥其性腺发育就会受到限制。
饲料投喂品种要多样化，并且要求饲料蛋白质含量高，营养价值全面。
亲体培育过程中饲料质量的优劣关系到其性腺发育成熟程度的好坏。因而亲体培育主要投喂人工配合饲料，并根据娃娃鱼性腺发育的不同时期，添加中药生精散和促卵泡汤。投喂生精散和促卵泡汤是培育娃娃鱼性腺发育的关键技术因素。
生精散和促卵泡汤的药理及促进雌、雄娃娃鱼性腺发育的作用机理将另文报道和出版著作。
5、冲水刺激
流水刺激是亲体培育的重要环境条件，也是亲体性腺发育成熟的生态因子。因而，亲体阶段实行冲水刺激性腺发育是一项重要技术措施。每年在3～8月份进行人工冲水培育亲体。每天冲水两次，每次0.5～1小时。
6、PH值
要求在6.5～7.5之间，绝不能偏碱性。
生理学方法：是把丙酮处置过的脑垂体制剂、维生素C和E、维生素B族注射到雌体和雄体肌肉内，可以得到成熟的卵子和精子。
娃娃鱼机体内，联结神经系统与性腺的脑垂体，是生殖细胞成熟的重要控制器官。脑垂体是一种内分泌腺，能产生出特殊物质－－激素，在激素的作用下，亲体进入性成熟状态。
生理学催熟剂配方见表4－2。
亲体培育，是一项重要的工作，其日常管理工作有控温、投饲、巡池、调节水质和防治疾病等。
一、巡池
巡池的目的，是观察情况，发现问题，以便及时采取措施。及时加入新水，控制好水温。
二、投饵
投饵是亲体培育管理工作的重要环节，亲体要求生态环境条件适宜，投饵是娃娃鱼性腺发育成熟的物质基础，性腺发育需要营养物质补充机体消耗。
投饵要做到定时、定位、定质、保量。饵料要求以泥鳅、黄鱼鳔、鲫鱼等为主。饵料最理想的是投喂人工配合饲料，这些饲料含有亲体性腺发育所需的活性物。特别是人工配合饲料可添加促进娃娃鱼性腺发育的活性物及饵料引诱剂，人工配合饲料在性腺发育期间，要添加中药生精汤和促卵泡汤，中药制剂具有激素样作用，它对垂体促黄体素释放激素（LRH）受体功能以及垂体对LRH的反应具有促进作用，它能提高垂体对LRH的反应性及卵巢对LH的反应性。它的作用是通过丘脑下部反馈刺激而产生的。可见，在娃娃鱼配合饲料中添加适量中药生精汤和促卵泡汤，有利于性腺发育成熟。
排水管
雄 鲵 培 育 池
雌 鲵 培 育 池
供水管
图4－2 娃娃鱼亲体培育池示意图
表4－2 生理学催熟剂配方表
药 物 剂 量
高效催产素（内含多巴胺、垂体类似物） 10 IU
维生素B,C,E 1/10 ml
三、调节水质
水质好、清新、透明度高也是亲体培育的一个重要环节，调节水质主要是及时清除残饵、粪便，及时换水。将新水用净化、矿化装置过滤后才引入亲体池中，使亲体生长发育有一个优良的水环境。
水质调控与管理
1．水质调控与管理
水质管理技术已成为制约大鲵业持续健康发展的一个重要因素。保持良好水质是实现大鲵繁殖的首要条件。掌握和了解养殖水体中物理、化学和生物运动变化规律，以及对鱼类和大鲵养殖生物所产生的影响，从而采取有针对性的措施，避免水质恶化，为鱼类和水生生物创造适宜的生态环境，才能达到提高养殖产量和经济效益的目的。水质调控与管理的内容包括以下几个方面：
(1)水环境化学成分的动态规律 作为大鲵养殖人员，首先应了解天然水中有哪些成分，这些成分和大鲵养殖的关系，这些成分在水体中的分布及变化规律，养殖水体水质有何特点等。这就要学习天然水与养殖水中常见的化学成分的来源、迁移、分布、变化。要将溶解、电离、氧化还原、络合、吸附等平衡原理用于研究水环境化学状态的成因及变化，就不可避免地要涉及到对水质产生影响的生物学、微生物学、生态学、地质学、地球化学等学科的知识。
(2)水质控制方法 大鲵养殖专业人员的工作重点应放在管理和调控水质上，控制水质是繁殖的重要任务，也是养殖技术的重要组成部分。通过各种物理、化学、生物的方法科学的、合理的调节水质，是达到稳产高产优质目的的关键。
2.生态养殖对水质调控的内容有更高的要求
从养殖水体与周围环境的关系上考虑，养殖水体污染有两方面的含义：大规模高密度集约化养殖模式，加深了江河的富营养化、微生物大量养殖、病害越来越多，而且流水养殖模式，造成疾病的传播越来越迅速，水源的卫生程度每况愈下；从可持续发展的观点看，大鲵养殖必须走生态养殖的道路。
3.生物净化调节水质
随着科学技术的进步，生物工程技术在大鲵养殖业的开发应用日益引起人们的重视，并且已经发挥了巨大的作用，有益微生物在大鲵养殖上的应用和研究已有近十年历史。目前，世界上都认为直接应用有益细菌是无公害健康养殖的重要技术手段。在现代化集约式精养大鲵系统中，大鲵的排泄物、残饵沉积物等严重地污染着养殖水体，从而也为滋生病原体微生物养殖创造了条件，导致大鲵病的发生。如果单纯地使用化学与物理方法处理水质，不但成本高，生产实践表明，预防病害的效果也并不理想，过多地依赖化学药品，有时会产生二次污染问题及食物安全问题。已经有大量的事实证明，养殖过程中，重视使用微生物制剂，保持养殖水环境的生态平衡、水质稳定，可以使大鲵健康生长。有益微生物正常养殖生长，可以有效地防止底质恶化、预防病原微生物养殖、抑制病原体的生长、保持良好的养殖环境。
当前我国常用的作为环境保护改良水质、底质的有益微生物制剂有两大类：一类是利用能的光合细菌，另一类是有益的化能异养细菌。
（1）.光合细菌目前在养殖生产上应用较多的是红螺菌科的菌种，该类细菌能利用光合色素，在厌氧、光照条件下进行光合作用。但是不产生氧，有别于微藻的光合作用。基本上利用小分子有机物作供氢体，也能利用硫化氢作供氢体。光合细菌在池塘底部，对池水及底泥腐殖质中的氨氮、硫化氢、有机酸等有很好的利用，因此能迅速净化水质。但是该类菌基本上不能很好地利用大分子有机物如蛋白质、淀粉等。大鲵池使用的光合细菌，应该是培养基的盐度和养殖池盐度接近的光合细菌，活菌量不低于10亿一15亿个／毫升，每亩至少施用10升，主要撒播在池底，以后定期每20天施用一次。 光合细菌分为产氧光合细菌和不产氧光合细菌。产氧光合细菌主要是蓝细菌（Cyanobacteria )，或称之为蓝藻（Bluegreeryalgae）和原绿藻（Prochlorales），它们是微藻学家研究的主要对象。不产氧光合细菌即人们常说的光合细菌，它们分为四种：红螺菌科（Rhodospirlloceae）、着色菌（Claomatiaceae）、绿色菌(Cholorobiaceae）、曲绿菌（Chloroflexaceae）。
光合细菌的特点：在厌气光照条件下吸收各种光谱，利用光能把有机物作为氢的供体而固定二氧化碳或低脂类有机物作为磷源而生长和发育，其生长过程中不产生氧气。光合细菌的种类较多，而且在形态、色泽、利用和产生物质方面均不甚相同。用途：它除能消除硫化氢等有害物质外，还含有丰富的氨基酸、维生素Bj2、维生素H,其脂质成分中还有菌绿素类、胡萝卜素、辅酶Q，因而可以作为饲料添加剂，促进大鲵生长，预防病害发生。光合细菌在大鲵养殖上的作用，相当于净水剂＋饲料添加剂＋抗病剂＋促生长剂。
有光合色素，能进行光合作用，不放氧
利用硫化氢、有机酸做受氢体和碳源
利用氨基酸、铰盐、氮气、硝酸盐、尿素做氮源
不能利用淀粉、葡萄糖、脂肪、蛋白质等大分子有机物
图4-3光合细菌的基本特点
（2）.化能异养细菌 在水质净化，环境保护和环境修复方面应用比较多。我国目前市场上常见的菌种有芽抱杆菌属（Bacil-lus）、乳杆菌属（Lactobacillus）、亚硝化单胞菌属（Witro-somonas）、硝化杆菌属（Nitrobacter）、假单胞杆菌（Pseu-domonas）等一些菌株。这些细菌有好氧的、厌氧的兼性厌氧，能利用蛋白质、糖类、脂肪等大分子有机物及酚类、氨、有机酸等，将其分解为小分子，进一步矿化成无机盐，供微藻利用。一方面，这些细菌大量养殖，成为优势群落，占领生态位，可抑制病原微生物的滋长养殖。另一方面，提供营养促进单细胞微藻养殖生长，调控水质因子。其中芽抱杆菌属菌株以具有性状稳定，不容易变异、胞外酶系多、降解有机物速度快、对环境适应能力强、产物无毒等特点已成为池塘养殖广泛应用的代表性菌株。
（3)硫杆菌
种类与性状：广泛分布在淡水、海泥、池泥及其它土壤中，其代表种类有排硫杆菌（Thiobacillas thioparus）、氧化硫杆菌（T ．thiooxidans）分泌胞外酶，降解大分子有机物，如：淀粉、葡萄糖、蛋白质、硫杆菌在有二氧化碳及碳酸盐的条件下生长。在大量硫化物存在情况下，硫化物被氧化成硫沉淀于细胞外。硫杆菌一般在25--30℃培养液中2--4天生长。菌落白色或淡黄色，圆形，全缘，大小为0 ．2一0 ．3毫米；细菌短杆状，大小约为0.5一1.5微米，无孢子，能运动，革兰氏染色阴性。当硫杆菌旺盛生长时，可使其生长环境的pH由7．5降至3---3．5或更低。
脂肪、纤维素、核酸、磷脂等
性状稳定、不易变异
对环境适应性强
产物无毒
图4-4芽抱杆菌（Bacillus）的功能特性
芽孢杆菌作用流程： a降解转化池中污染物
b 修复池中生态系统统
c 抑制有害病原菌
d 平衡藻相
用途：硫杆菌属的细菌，能使硫或硫的不完全氧化物转化成硫酸盐等物质，并能参与水或土壤中的硫循环作用，改良土壤和水质。水中积累的硫化氢等有毒物质，可在硫杆菌作用下转化为无毒物质，使水质稳定，有利养殖。
（4）硝化细菌
种类与性状：硝化细菌是一种氧化氨或亚硝酸盐的硝化杆菌科的细菌，分为两类：
①亚硝化单胞菌（Nitrosomonas sp.）：杆状，0．8一1．0微米，单生，有极生鞭毛，为菌体的3---4倍。革兰氏染色阴性，有细胞质膜，为专性化能自养细菌，不需有机生长因子，严格好氧，生长环境的pH为5．8一8．5，温度为5一30℃。
②硝化杆菌（Nitrobacter sp.）：短杆状，楔形或甲梨形，一般不运动，多为专性化能自养细菌，生长环境的pH为6.5-8.5，温度为5一40℃。其有10余种分布在海洋、淡水和土壤中。
作用与用途：在水体中，腐败细菌可把动植物体分解为氨氮或氨基酸。固氮菌等可把游离氮变成氨，而生长在水环境中的硝化细菌能把氨或氨基酸转化为硝酸盐或亚硝酸盐，放出热量，使水体中有毒物质分解为无毒成分。
用法与用量：硝化细菌是靠固定二氧化碳满足对碳素的需求，故在一定条件下，引人相应少量的硝化细菌便可养殖。
亚硝化细菌生长较慢、代距长。而亚硝酸盐在硝化细菌的作用下转化为无毒的硝酸盐，这个过程常常发生在极短的时间内。
因此，亚硝化细菌和硝化细菌（有些硝化细菌同时具有两种细菌的功能）同时存在，对水中有害的氨和钱离子、亚硝酸盐迅速转化为无害的硝酸盐十分重要。
③反硝化细菌：它由具有反硝化作用的一组微生物种群组成，主要用于处理底质的烂泥。在水体底层溶解氧低于0.5毫克耳｝、pH8-9条件下，反硝化细菌利用底泥中有机物作为碳
源，将底泥中硝酸盐转为无害的氮气排人大气中，或转化为有毒性的亚硝酸盐、氨、铰离子，留在池水中。反硝化过程消耗了大量的底层发酵产物和沉积于底层的有机物，底层污泥中有机物和硝酸盐的含量迅速减少，这样，可有效预防因天气突变引起的水质剧变大鲵类的影响。可见，在大鲵池内使用反硝化细菌利大于弊。
利用反硝化细菌处理底泥的污染，减少底泥中硝酸盐的含量，关键是选择好菌种。使用通过实验室筛选反硝化主要产物为氮的反硝化菌株，才能做到既减少底泥有机物和硝酸盐含量，又能保持水质长期稳定。
四、调节光照
光对娃娃鱼繁殖功能的影响是很复杂的，生态及生理研究尚未探明其机制。光是通过脑和眼影响到脑下垂体的机能，刺激其前叶分泌促性腺激素，从而使性腺生长发育。娃娃鱼生活在无光带（aphotic zone）性腺才会发育成熟；它对光产生负反应-背光运动。娃娃鱼性腺发育适宜光照Lux100-2500。
五、防治疾病
娃娃鱼亲体疾病防治以预防为主，防治结合，常年进行，重视4-9月预防。定期进行亲体检查。
预防用中药五倍子，每立方米水体浓度为3ppm。
病害治疗，则实行隔离，单独针对实际疾病进行治疗。
一、雌雄外部性状的比较（表4－3）
从表4－3可以看出，雌雄娃娃鱼身体各部分的长度、宽（高）度以及它们之间的比例上没有显着的差异，不能作为鉴别依据。
二、鉴别特征
泄殖孔的特征（图4－5）：
（一）雄性泄殖孔略大，周围外凸，形成椭圆形的隆起圈；雌性泄殖孔小，周围向内凹陷。
（二）雄性泄殖孔外有一圈不规则的小白点突起，雌体泄殖孔外无小白点突起。
（三）解剖后可见：雄性泄殖孔内皮下有两瓣杏黄色的泄殖腔腺体，围成椭圆形，腺体能分泌一种胶丝状的粘液，雌性无此腺体。
表4－3 雌雄娃娃鱼某些外形性状的比较 单位：cm
标 本 数 | 雌 鲵 | 雄 鲵 | |||
（尾） | 30 | 19 | 22 | 21 | 6 |
全 长 | 25-46 | 53.5-91 | 26.9-55.5 | 59-93.2 | 105.5-125 |
体 宽 | 3.5-7.4 | 7.8-`6 | 4.1-8.1 | 7.6-16 | 19.5-26 |
头 宽 | 3.0-7 | 7.1-14 | 3.6-7.5 | 8-14.6 | 19.6-22 |
尾 长 | 6-16.5 | 19.7-32 | 9.3-20 | 19-33 | 31-47 |
尾 高 | 2-4.5 | 4.9-12 | 2.9-5.5 | 5.4-9.1 | 11-15 |
头宽/体宽 | 0.86-0.91 | 0.91-0.88 | 0.86-0.93 | 1,05-0.91 | 1.00-0.85 |
全长/体宽 | 7.14-6.21 | 6.86-5.96 | 6.56-6.84 | 7.76-5.83 | 5.41-4.76 |
尾长/尾高 | 3-3.63 | 4.03-2.60 | 3.21-3.63 | 3.52-3.62 | 3.55-3.95 |
三、亲体选择
成熟亲体是进行人工繁殖的物质基础，亲体成熟与否，决定着人工繁殖的成败，因而成熟亲体的选择极为重要。要求亲体健壮无伤，体重2公斤以上。
雌性亲体腹部膨大而柔软，用手轻摸腹部，有饱满松软且富有弹性之感，还可将亲体托起，观察腹部蠕动情况。有蠕动，可
选作亲体供催产。腹部膨大，手摸有硬的手感则不能选为亲体。
雄性亲体泄殖孔内周边有一圈突出的小白点，周围桔瓣状隆起，内周边红肿，明显可见充血现象。在催产前后，可挤取精液
进行镜检。成熟精子，必须数目多，呈单个游离，稍加水滴就能游动，这种精子才有授精的能力；若镜检时精子未能单个游动、无力，这种精子是不能使卵受精的，这也是人工授精成败的主要原因。
四、娃娃鱼卵的成熟概况
（一）卵成熟的环境温度：娃娃鱼卵成熟与水温密切相关，水温在10℃以下，大部分卵已充分生长，停留在卵巢中。当水温上升至12℃时，即继续发育。研究证实，卵发育适宜水温在16－23℃，而最佳温度为18－21℃。
（二）卵成熟以前要经过休眠期，即卵母细胞生长需要低温，晚期卵母细胞生长则需要高温。娃娃鱼卵母细胞的生长与发育正是在环境水温下降而身体细胞停止或减缓生长的时候进行的，这是它的性腺
发育规律。娃娃鱼性腺发育要经过一段冬眠期才可能获得具备受精能力的卵子。这就是说，自然冬眠、人工冬眠都有促进雌性生殖细胞成熟的效能，反之，不通过冬眠（低温）和低代谢率的阶段，卵子无法成熟。
卵子只有达到生理和形态上的成熟才具备受精能力。
一、催产
（一）催产剂：娃娃鱼催产药物制剂可根据精卵成熟情况而使用。
1、蛙脑下垂体（简称蛙垂）用丙酮脱水干燥保存的。
2、鲤鱼脑垂体（简称鲤垂）用丙酮脱水干燥保存。
3、鱼用激素（包括LRH-A，HCG）。
4、鱼用激素RES或DOM。
5、娃娃鱼脑垂体（简称鲵垂）用丙酮脱水干燥保存。
6、无鳞鱼类催产剂（宁波激素厂生产）。
（二）催产药物配制（激素配制）
使用脑垂体时，先将垂体碎细，用0.65％的生理盐水或注射用盐水与脑垂体粉末配制成混悬液。使用激素时，只需将注射用水溶解即可，若使用脑垂体、激素混合液时，应先把脑垂体配制成上述混悬液后，再加入一定比例的激素于垂体悬液中，混合均匀即可。
（三）催产剂的组合
1、蛙垂＋激素
2、鲤垂＋蛙垂＋激素
3、鲵垂＋激素
4、LRH-A ＋ HCG
5、RES＋LRH-A＋DOM＋HCG
6、无鳞鱼类催产剂
（四）注射次数，一般采用一次注射，也可采用二次注射，亲体注射次数，主要是视其性腺发育成熟度而定，一般成熟好的亲体，采用一次注射即可。若性腺成熟较差，最好采用二次注射。两次注射，就是把预定的药剂量分两次注射。第一次注射药量大约每公斤亲体注射垂体干重0.3-0.6毫克，第二次注射则是将剩余的药量全部注入亲体。应该强调的是：分两次注射的，必须注意控制第一针的剂量，特别是对于成熟较好的亲体，更要严格控制，若第一针的剂量高了，容易造成亲体早产，而且产得不好；有时即使产下不少卵，但受精率低。
雄体也应分两次注射，因为雄体成熟要比雌体稍迟。为了获得成熟精子，要提前一周对雄体进行催熟。
两次注射比一次注射效果好，亲体发情的时间比较稳定，催产率、受精率和孵化率均比较高。两次注射符合娃娃鱼生理客观规律，它有利于精卵母细胞成熟的准备，使成熟过程能比较顺利地进行和完成。对于成熟不够充分的亲体，采用两次注射，可避免亲体的生理反应过急，从而引起卵子的成熟和排卵的失调，影响产卵和受精效果。注射部位为背部肋间。
（五）注射剂量：注射剂量视亲体的成熟度而定。一般成熟程度较好的亲体，注射剂量可少些；成熟程度较差的，注射剂量即应加大。
根据上述催产剂组合、亲体雌体以每公斤体重为单位，其注射剂量的配制比例如下：
1、.蛙垂2-3个＋激素（LRH-A 50ug/kg＋HCG 500-1000 IU）；
2、鲤垂1-2个＋蛙垂1-2个＋（LRH-A 50ug/kg＋HCG 300-800 IU）；
3、鲵垂2个＋LRH-A 80ug/kg＋HCG 800IU；
4、LRH-A 50-60 ug/kg＋HCG 800-1200IU；
5、RES.＋LRH-A＋DOM＋HCG 混合为 LRH-A 50-55ug/kg HCG为600-1000IU。
6、雄体注射剂量减半。
图4－5 雌娃娃鱼和雄娃娃鱼泄殖孔的特征
二、催产效应与授精
（一）催产效应：系指从催产开始到雌体卵子成熟即滤泡破裂排卵的过程及其时距，娃娃鱼的催产效应时间很长，通常需要4-9天，但是也有部分雌体因卵巢成熟极好，在催产时卵巢已接近Ｖ期，故注射适量催产药物之后，其效应极快，在4-5天内可发情排卵。并且催产率和受精率也很高。因此，注意选择成熟度好的雌体和雄体，适时适量地进行催产注射是极为重要的，同时注意准确地掌握催产后亲体卵子的成熟变化过程及发情时间，适时进行授精是提高受精率的重要环节。
（二）人工授精
娃娃鱼人工授精是采用干湿法，其具体操作是，待雌体在池中产出卵胶膜后，随即从水中将娃娃鱼捉起轻轻放入布担架内，并用湿的黑布蒙住其头部，然后一人用手将尾部向上稍稍托起，另一人手端干净搪瓷盆，盆内不盛水，但要保持潮湿。可事先用0.65%生理盐水冲洗。用消毒过的手托住卵带一端向下轻轻让卵缓缓地流入盆中。如遇卵在泄殖孔内受阻，则只能用手卡断卵带，待一段时间再继续进行。千万不要用力过猛，因为用力过大易使卵子变形，产出也无用。当卵带托入盆中有一定数量后，立即轻压雄体腹部，挤取精子滴在卵带上，加几毫升0.65%的生理盐水，最好是加几毫升精子营养液，再用两手托盆缓缓摇动，使精卵充分混合。待5-10分钟后，加入少量蒸馏水，过约半小时，将盆中的水换两次，即可分盆进入孵化阶段。
三、催产试验比较
娃娃鱼人工催产见表（4－4、5）。
娃娃鱼亲体催产比较有效的剂型是：娃娃鱼垂体＋激素， RES＋LRH-A＋DOM＋HCG，其次是LRH-A＋HCG。
在娃娃鱼人工繁殖工作中，经常遇到不能同时产卵、排精问题，致使受精无法进行。因而，精液离体保存是保证人工繁殖顺利进行的重要的生物技术措施。
一、精液的采集 雄体性腺发育成熟后，采用激素催情，用清洁布擦干其泄殖孔，再用２０％酒精棉球消毒。然后轻压雄体腹部，迫使精液流入试管中。为了避免精液污染，取精液时，将先流入的精液弃去。取精后，迅速用橡皮塞塞住试管口，并密封保存。
表4－4 2001－2004年娃娃鱼催产率情况
年份 | 催 产 率（％） | 平均值 | |
雌 | 雄 | ||
2001 | 30.5 | 29.6. | 19.35 |
2002 | 68.2 | 40.5 | 54.35 |
2004 | 90.1 | 55.2 | 72.65 |
表4－5 2004－2007年娃娃鱼催产率情况
年份 | 催 产 率（％） | 平均值 | |
雌 | 雄 | ||
2004 | 18.2 | 20.5 | 19.35 |
2005 | 68.5 | 40.2 | 34.27 |
2007 | 88.3 | 65.8 | 77.05 |
二、精子的形态及活力观察
（一）精子形态，娃娃鱼精子分头、颈和尾三部分。头部为棒状，前端稍细，后端略粗。
（二）观察精子活力的方法及密度检测
1、精子密度（sperm density）是指每毫升精液中的精子数目，也可以精子计数（sperm count）或精子浓度（sperm concentration）表示。采用血细胞计数器按照红细胞计数方法进行检测。
精子计数方法：于小试管内加精子稀释液190 ul，另将完全液化的精液摇匀，用血红蛋白吸管吸取10 ul加到含有稀释液的小试管中，并充分混匀，取稀释的精液滴于血细胞计数器内，覆盖玻片，于室温条件下放置2-5分钟使精子完全沉淀。然后从高倍镜计数标准血细胞计数器中间的大方格，即25个小方格内的精子（图4－6）。
以精子头部压线为标准，所得精子数乘以2×105即为原精液所含精子数。
精子密度＝25个小方格精子数（为1个大方格内0.1mm3）×10(为1mm3数）×20（稀释倍数）×1000（为1ml数）即1个大方格精子数×2×105＝精子数／ml.。
精子总数＝精子密度×精液量／次。
测定精子密度，初检时可用估算方法。即将液化后的精液混匀直接涂片，于高倍镜下观察若干视野中的精子，其平均数乘以106，即为每毫升精子数。如每个视野平均有70个精子，则精子数为70×106／ml。
①精液稀释液配制：
NaHCO 5mg；35%甲醛 1ml；饱和龙胆紫液0.5ml，加生理盐水至100ml。稀释液中NaCO3可溶解粘液，甲醛有杀死或抑制精子活动的作用,龙胆紫可改善镜检时清晰度。
②精液计数用微量吸管，吸取量较为准确。
③吸取精液前一定要将精液充分混匀，再进行稀释。
精液加到血细胞计数器上应至少放置1分钟，使精子沉积，以便计数。
2、精子活动度
精子活动度一般分为精子活率（sperm activity rate）、精子活力（sperm motility）及活动期（activity period）。精子活率是指正常活动精子的数目，是测定活精子和死精子比例的定量方法。而精子活力则是指正常活动精子的质量，是测定精子活动能力的定性方法。
精子活力检测方法：通常用压片法，将完全液化的精液充分混匀，取1滴置于清洁玻片上，加盖玻片，37℃或室温静置1分钟，低倍镜随机选择10个视野，观察精子活动状态，按WHO推荐方法将精子活力定为4级。
ａ级：精子活动良好，有快速、活泼的直线向前运动。
ｂ级：精子能活动，但方向不明确，呈快速或迟钝的直线或非直线向前运动。
ｃ级：精子活动不良，原地打转或旋转移动，向前运动能力差。
ｄ级：精子不活动。
附注：
1 | 2 | |||||
5 | ||||||
3 | 4 | |||||
图4－6 计算1、2、3、4、5小格
三、精子冷冻技术
大鲵精子冷冻已有200余年历史，但由于当时条件限制，低温冷冻的精子大多死亡，因此难以达到实际应用。随着现代低温生物学及其相关学科的发展，以甘油为冷冻保护剂（cryoprotective medium,CPM）的发现和液氮冷冻精子技术的问世，使精子冷冻的研究获得了突破性进展。
（一）精子的保存 根据保存温度的不同，精子离体保存的方法可分为常温保存、低温保存（0-4℃），超低温保存（－196℃）等三种。
1.常温保存是将盛满保存精液的容器存放在室内，其温度随气温的变化而变化。
2.低温保存是将盛满精液的容器直接放入装满冰块的冷藏瓶内，其温度保持于0-4℃之间。
3.超低温保存，又叫液氮保存，是将盛满精子的容器放入装满液氮的液氮罐内保存，其温度低达－196℃。
目前超低温保存鱼类精液的配方有几种：
鱼用任氏液 100毫升
NaCl 0.78克
KCl 0.02克
CaCl2 0.021克
Na2CO3 0.0021克
存放精液时，将新鲜精液以任氏液稀释10倍（最好分两步，先稀释5倍，然后稀释到10倍）再从每分钟降1℃的速度逐步降到2℃，最后放入0-4℃的冰箱内。娃娃鱼精子可成活3-6天。
葡萄糖－－柠檬酸钠保存液
葡萄糖 2.9 克
柠檬酸钠 1.0克
碳酸氢钠 0.2克
氯化钾 0.03克
磺胺 0.3克
蒸馏水 100毫升
存放时，将新鲜精液用此保存液稀释3倍，再逐步降温，降温至3℃，放入保温瓶内。在3-8℃的条件，鲤鱼精子可成活12-18天；中华鲟精子可成活2-8天；娃娃鱼精子可成活3-9天。
（二）精子超低温冷冻的机理与冷冻保护剂类型
1、冷冻机理
精子的冷冻贮存机制十分复杂。一般认为精子在液氮（－196℃）及适宜ＣＰＭ条件下，能避免自身结构和功能的损伤，并使精子代谢活动完全停止，以生命的休眠状态静息保存，而在一定的环境中可使精子复活。
2、冷冻保护剂类型
（1）甘油－卵黄－柠檬酸钠型（G-Y-C型）
G-Y-C型为复合型CPM。配制方法：
甘油 14%
卵黄 20%
5%葡萄糖与2.9%柠檬酸钠混合液（V/V．2:3）66％，
甘氨酸 2 mg/ml
青霉素 1000 µ/ml
链霉素 0.5 mg/ml。
用1.3％重碳酸钠调pH至7.2-7.4。
冷冻具体作法：将精液缓慢加入G-Y-C复合型CPM，速度为1-1.5滴/min，边加边轻轻摇动，混合均匀，然后置室温15分钟，使CPM渗入精子内，起到冷冻保护效果。最后放入液氮（－196℃）罐内。
（２）TES－Tris－卵黄－柠檬酸钠型（TEST-Y-C型）
TEST-Y-C型为无甘油的具两性离子缓冲系统的CPM。配方：
325 mosm TEST （pH7.0）70%
卵黄 17.5％
325 mosm柠檬酸钠12.5%，pH为7.0
本文只选用这两种配方，供参考
（三）精子超低温冷冻程序
１.简易速冻（simplified quick fieezing）法
（1）精液收集与筛选：采集的精液放于洁净器皿内及时送检，精液液化后观察精子密度、活率、活力。尽可能选择质量好的精液，要求冻存精子活力为ａ－ｂ级。
（2）液化精液经过容量测定，室温下将CPM以每分钟1滴速度加到精液中，轻轻振荡使精子甘油（冷冻保护剂）混匀，静置15分钟。精液与保护剂体积比为2：1。
（3）分装与初冻：取药用安瓿瓶割除瓶口多余部分，用水冲洗，然后以蒸馏水清洗，高压灭菌后可使用。用不带针头的注射器吸取精液保护剂混合液，每支安瓿瓶分装1 ml，用消毒的塑料帽封闭。置冰水内或移至4℃预冷10分钟。
（4）液氮蒸汽冷冻，将经过预冷的精液安瓿瓶移入小纱布袋中，缓慢放入液氮罐内，立即悬吊于液氮蒸气中8分钟，然后浸于液氮内。
２.缓冻（slow freezing SF）法
(1)混合精液标本置于普通冰箱缓慢降至2-4℃，静置40分钟。
(2)以5-7℃/min速率，使精子从4℃降至－30℃。
(3)再将精子在２分钟内以8-10℃/min的速率降至－80℃。
(4)最后完全浸入液氮中冻存。
（四）精子冷冻技术结果解释
精子冷冻保护剂，分为膜内保护剂（如甘油，二甲亚砜）、膜外保护剂（如葡萄糖、蔗糖等）和高分子保护剂（如PVP、白蛋白等）。甘油作为一种无色透明的油类物质，其亲水性强，具有高渗透压与高渗透性。在冰点下不形成冰晶，（因为冰晶所造成精液的化学改变及机械损害是不可逆的，精子由于发生膨胀、破裂，最终导致死亡）可呈玻璃态，渗入细胞内，促使电解质与水结合，有效地阻止脱水及冰晶的产生，对低温下的精子有一定的保护作用。可减轻因电解质紊乱对精子的损害，防止低温引起的蛋白质变性。对因酸碱度、渗透压改变及有害产物的积累所造成的细胞损伤也有一定的缓冲作用。
对于精子解冻复苏多用37℃水浴复温，近有报道室温（22℃）慢复温较快复温（37℃）效果要好，室温复苏作用较缓，可提高精子的活力。
有关娃娃鱼还没有进行精子的超低温冷冻，以上冷冻技术只供读者作参考。
娃娃鱼人工授精，有时雌、雄体不能同时产卵、排精。利用精液保存法，贮备精子，可以解决这一矛盾，且能充分发挥雄体的作用。
总之，娃娃鱼人工繁殖过程中有四个重要因素必须引起足够注意，它关系到人工繁殖的成败。
1.必须培育出成熟的亲体，它是人工繁殖的物质基础。
2.选择适当的催产剂量和掌握亲体催产后效应时间。
3.要提高雄性娃娃鱼精子活力。
4.雌体性腺发育成熟时间要比雄体性腺成熟稍早一点时间，这就是说雄体性腺成熟比雌体稍晚。因此，必须对雄亲体实行提前催熟，或提早加温培育，同时采取有效措施添加中药生精汤投喂配合饲料进行培育，以使娃娃鱼雌、雄性腺发育成熟时间基本相同，这样有利于娃娃鱼人工繁殖。
一、孵化的生态环境条件
（一）水温：娃娃鱼受精卵的孵化水温在自然界为14-20℃，孵化时间为35-40天。人工控温22-23℃只需28天，水温在18-19℃时，则需要36天。由此可见，娃娃鱼受精卵孵化水温最适宜范围在22-23℃，并要求水温较稳定，不要急升、急降，其温度变化范围不要超过±2℃，如孵化水温在短时间内上升3-5℃，即可造成胚胎发育畸形或引起死亡。
（二）溶氧量：娃娃鱼受精卵要在含氧量很高的流水中发育。据试验，水中溶氧量低于3mg/L，对胚胎发育会产生抑制作用，甚至造成受精卵窒息死亡。故娃娃鱼受精卵在孵化期间，水中溶氧量不得低于3mg／L，受精卵的孵化适宜溶解氧为6-8mg／L。
（三）避免强烈光照：据试验，在阳光曝晒下进行人工孵化，孵化率为零。因此，娃娃鱼受精卵在完全黑暗条件下孵化，或有散射光线条件下孵化，效果相似。适宜娃娃鱼的光照强度为Lux50-300。
（四）水源：娃娃鱼受精卵孵化水源可选用井水、自来水、水库水。自来水的孵化率为67％，井水的孵化率为53％。孵化水源无论用那种，先将其净化、矿化装置离子交换处理后，可提高孵化率。
（五）水质调节方法参照本书亲体培育水质调节方法。
二、人工孵化方法
目前，娃娃鱼受精卵孵化方法有静水孵化、流水孵化、环道孵化、圆形孵化器孵化、仿自然生态孵化。
无论选用哪种方法孵化都应进行消毒，防止霉菌的滋生，造成胚胎死亡。常用的消毒药物为孔雀石绿溶液，以10 ppm浓度，浸泡鲵卵15分钟，也可用有机碘30 ppm浓度，浸泡受精卵15分钟，其消毒效果较好。
（一）“静水孵化”，所谓静水孵化，水并非全然不动，而是要定时换水，每天换新鲜水5-6次，换水时要使胚胎缓慢地翻动，以免长期不动而发生胚体“贴壳”的不正常现象。通俗地说，就象母鸡孵化小鸡时要翻动鸡蛋一样，娃娃鱼的胚体也需要翻动。
（二）流水孵化：可在环道池内，让水微流，防止卵集于中央，水从溢水口流水，而卵在池中缓缓随水而浮转。
（三）仿自然生态条件孵化法：就是在池内载种夜号子树，让树根伸入池水，受精卵集于树根下，流水孵化。
三、孵化时水质的理化因子
娃娃鱼受精卵孵化水源以自来水和地下水为例，中国娃娃鱼科学研究院长江娃娃鱼研究所进行的水质测定见表4－6。
目前，娃娃鱼人工孵化还未形成规模，技术还不够完善。因此还须进一步研究人工孵化方法，以提高孵化率。
娃娃鱼在大鲵发生中占有重要地位。在系统发生方面是作为水生向陆栖脊椎大鲵过渡的一类大鲵；在个体发生中重演了水生脊椎大鲵许多性状，在其进化过程中又获得了陆栖脊椎大鲵的许多特征。娃娃鱼胚胎发生过程中一个显着的特点是变态，它表现在幼体用鳃呼吸、有成对的副肢，而变态后成为用肺呼吸和具有能在陆地上运动的五指形附肢的成体。
娃娃鱼卵的受精是个体发生的开始。卵要达到受精的目的，除了卵本身必须完成它的生长及生理成熟外，卵细胞外表的各种卵膜及外界条件都具有重要作用。
一、娃娃鱼的胚胎发育
娃娃鱼的胚胎发育按其形态结构变化的主要特征，可划为十七个时期。要达到某一发育时期所需要的时间，称为时序，了解娃娃鱼胚胎发育的时序，对掌握娃娃鱼的胚胎发育、人工孵化、人工繁殖等都有实际意义。时序的长短与水温有关（即呈负相关）。根据胚胎发育外部形态和生理现象可分为六个阶段。
（一）第一阶段－－受精卵和卵裂
娃娃鱼的成熟卵球较大，直径为6-7毫米，呈椭圆形。卵球内含有大量卵黄，呈桔黄色。娃娃鱼卵在卵巢中发育成熟，在激素和神经的支配下，从卵巢中跌入体腔。这种卵除了它本身的质膜外，紧贴卵球还有一层卵黄膜。由于体腔上皮细胞纤毛的摆动，卵进入输卵管，随之而被输卵管分泌的胶膜所包。当卵产出体外后即有三层膜：即外包膜、胶体膜和卵黄膜。输卵管的不同部位所分泌的胶膜其性质不一，有不同的粘度和浓度。其化学成分为硫酸粘多糖，水解后产生己糖、氨基己糖。胶膜的生理作用是对精子起获能。
卵受精后，在水中其外包膜与胶膜吸水膨胀，卵的外包膜直径可达16-17毫米。外包膜微带粘性，胶带中每个卵之间距离为20毫米。其胶带富有弹性。其卵为半浮性卵，在静水中可沉水底，在流水中则漂浮在水中。
娃娃鱼受精卵与水接触后，在其卵胶膜膨胀的同时，卵球的细胞质开始向卵球的一端集中，形成白色帽状的胚盘，这时卵球在水中立定方向，即大鲵级（胚盘）向上，植物极（卵黄区）向下。未受精卵遇水后，也发生同样的反应。
娃娃鱼受精卵约23-24小时左右进行卵裂，第一次和第二次均为经裂，两者相互垂直，为盘状卵裂。其卵裂过程先是在胚盘出现一个小的凹陷部分，然后逐渐扩展为沟状；把胚盘分割成四个大小相等的分裂球。第二次分裂发生在第一次卵裂后的8-10小时。第三次为纬裂，位于赤道面以上，形为8个分裂球（为4大4小）。小的位于上面，靠近大鲵级，大的位于下面植物极。第四次为经裂，由二个同时的经裂面分为16个分裂球。第五次为纬裂，亦为二个同时的纬裂面，把上下两层的8个分裂球分为32个分裂球，共为四层；这次卵裂，上层略快于下层。以后的卵裂就不规则，同时速度也不一致，所以娃娃鱼受精卵的分裂为不等全裂。大鲵极小分裂球的分裂明显快于植物极的大分裂球，这主要由于大分裂球内含卵黄较多，分裂速度必然较大鲵极半球的要慢。经过几次卵裂以后，失去了细胞排列的规律性。即进入多细胞期。
（二）第二阶段－－囊胚到原肠胚
当卵裂进行到一定时间后，胚胎表面由于分裂球愈来愈小，且近白色半透明状，肉眼观察其细胞界限不太清楚。在最初几次卵裂中，卵裂面皆与原受精卵的表面成直角。随后的卵裂面又多与原受精卵表面平行，这样就使胚胎的分裂球成多层排裂，形成一个空球状的腔，称为囊胚腔。此时为囊胚期。由于原肠胚的形成，娃娃鱼卵胚开始变形，到原肠晚期、胚胎呈一头大，一头小的椭圆形了。
娃娃鱼原肠胚发生有两个特点：一是表现为卵黄区越来越多地被包围起来；二是随着细胞的不断分裂，细胞的内卷活动也在深入进行。
娃娃鱼原肠胚形成作用的主要运动方式为外包和内卷，辅以内陷，集中、分散、分层和展长。这些形态发生运动都是同时或陆续进行的，它们相互配合才能完成正常的原肠胚的形成，如果阻止某一运动方式必然导致不正常的胚胎。因此，我们了解原肠胚的形成必须有一个整体的、不断变化的，又相互联系的观点，而不能孤立地只看到一种运动方式。当然对于某一胚层或器官在它达到其最终部位时，常常是以一种运动为主的，这点我们也必须注意。
总之从囊胚发育到原肠胚分化为三个胚层，它们是通过各种形态发生运动，使各种器官原基达到其最终部位，同时胚胎外形发生变化，逐步达到所特有的形态特征。这种形成和建立新的形状和结构的细胞运动称为形态发生运动。完成这些运动形式主要是由于细胞伸直、扩展、折皱、收缩等而使部分细胞形状改变，结果造成三个胚层及各种器官原基的产生。娃娃鱼原肠胚形成方式是由于细胞以不同形式的运动而产生的，辅之以细胞数量的增加。
此外，除上述特点外，胚胎的位置也有所改变，即由原来卵黄向下、胚盘向上的立定方向，转为水平的侧卧方向。
（三）第三阶段－－神经胚到神经管期
当胚孔将近封闭时，胚胎的背壁上，开始出现一个宽阔增厚的神经板，接着由于脑部隆起和胚体前端腹面出一个弧形的表皮褶，使胚体显露出来，中间出现原沟，原沟两旁各有二褶，逐步高起如阜，形成神经沟，。随后两边内褶高举而抱合成神经管。联合区开始封闭，形成头部。
当上面胚胎从神经板变到神经管期间，其胚体向着神经管朝向的方向延长，即代表将来娃娃鱼身躯的正中纵轴。
这一发育特点是继原肠的形成，以至胚孔封闭，同时主要是中轴器官墓基和胚体雉形出现的过程。
（四）第四阶段－－尾芽到鳃板期
这一阶段胚胎的形态发生很大变化，首先表现在胚体逐渐伸长和出现体节。此时可见胚体伏于大的卵黄囊上；胚体的后端腹面出现一个微突的部分，乃是尾芽。并同时依靠尾芽组织较强的增生能力，在胚体伸长的过程中其尾部渐渐显露出来，以及神经管的前部显着膨大，头部更为明显，并向腹面弯曲。再向前发展，胚体头部出现鳃板芽。此时胚体进一步伸直。长约17毫米时，形成心脏、卵黄囊上呈现微红血管，体节数24，胚体头部视泡出现，头、尾开始弯曲扭动。
娃娃鱼胚胎卵黄囊前段时期大多呈椭圆形，随着胚胎的发育，此时已变成前端较细、后端略膨大的长葫芦状的卵黄囊。
（五）第五阶段－－前肢芽到后肢芽
胚体发育至21毫米时，鳃板出现分枝。心脏跳动清晰可见，其频率为每分钟33次；卵黄囊上微血管增多，胚体背部出现黑色素细胞，视泡明显，胚体能左右扭动，头部后缘出现白色的前肢芽。随后胚体向前发育，其视泡晶体形成，眼睛为黑色，胚胎可整个在卵黄囊上方翻身转动，其外鳃可见血液循环。
从前肢芽出现，经240个小时后出现后肢芽，此时卵的外包膜出现许多大小不等的圆筛孔，胶膜进一步吸水胀大，卵外膜的直径为24-25毫米。胚体的卵黄囊上呈现一排与胚体背部血管斜交方向的微细血管；此时前肢芽进一步长大，后肢芽呈淡灰色。
此发育阶段的主要特点是胚体血液循环在显微镜下清晰可见，无论在胚体的背尾部、卵黄囊和外鳃均有血液循环，其次是胚体黑色素增加，胚胎不时在胶膜内翻动，出现幼小生命的生机。
（六）第六阶段－－孵化
娃娃鱼胚胎脱膜时可见卵球的外包膜局部呈现破洞，其胶膜也变得薄而脆弱，胚胎又频繁地在卵膜内翻动，终于破膜而出，完成孵化过程。在14-20℃的水温变化范围条件下，从受精卵至胚胎脱膜而出，即整个孵化期需要38-40天，水温在18-22℃条件下，孵化只要25-30天。
刚孵化出来的娃娃鱼幼体，其体长为28-31毫米，身体的背部、尾部及头部均分布有许多黑色素细胞，使这些部位呈灰黑色，此时卵黄囊还未消失，在幼体的腹面仍带有长葫芦状的黄色卵黄囊。此时幼体口未开，尚不能进食。因此，刚孵化出的娃娃鱼幼体仍有一段胚后卵黄营养期，从孵化到卵黄囊消失约需28天左右。这一阶段形态变化特点是，刚出膜的娃娃鱼幼体形似蝌蚪，长28-31毫米，重0.28-0.3克，体表背面颜色呈浅棕红色，腹面为浅黄色，周身密布黑色素细胞，头稍向腹面弯曲，头前上颚吻端有外鼻孔一对，头前方背面两侧有一对深黑色的小眼睛，前肢旁的面、颈部左右两侧，各有三根须枝状外鳃，每根鳃枝上长着似绒毛的须状物14-15束，顺着一个方向伸出，由于血管的分布，呈桃红色，腹部由于卵黄囊较大，腹腔呈长椭圆形囊袋状，囊内积存的卵黄物质是幼体胚后生活的营养物来源，卵黄囊上分布的网状微血管肉眼可见，前肢已长成，但指无明显分叉，呈扁铲状，后肢芽长出，呈棒状，此时的幼体，主要运动器官后肢尚未发育完整，在水中还不能保持身体的平衡，多侧卧于水底。幼体的尾较发达，早期依靠尾在水中扭动，进行不规则的运动，一般约1-2小时游动一次。
幼体心脏结构简单，为一心房一心室，位于前肢附近的心包腔内，每分钟搏动33-35次。在卵黄囊与体轴平行的1/2位置上，有一根粗而显着的血管，即古维尔氏导管。血管主要分布在鳃、卵黄囊和尾肌等处。血液颜色不深，呈粉红色，以后逐渐变成鲜红色。
出膜后的6-8天的幼体长达35-40毫米，体色变深，背面深棕色。腹壁肌有所增厚，肝脏已形成，呈浅黄色。
出膜后的第6天，前肢开始分叉，只有一个分叉口，第8天前肢芽出现两个叉口，到第14天，前肢芽形成四指的雏形。15天后，口内下颌的锯齿状小齿已长出，前肢指已分4支，后肢指刚开叉，体两侧有2-3皮褶。此时幼体在水中游动有力，身体在水中能够平衡，少数仍侧卧水底。
出膜后26天，幼体全长为39-45毫米，胸腹腔已形成，食道与肛门连通，肠胃长17毫米，肝脏开始增大，分两叶，呈浅黄色，肾脏已出现，呈线状，白色。前肢四趾明显可见，可起支撑作用，后肢已开四叉，体两侧的肋沟皮肤褶明显，有13-14条。
出膜后30天，幼体长已达45-48毫米，体重已达0.5-0.8克，体色呈棕褐色，背面表皮上的黑色素细胞显而易见，腹呈肉白色，皮层微薄而透明。此时卵黄囊消失，幼体开始摄食，消化器官胃肠已形成，胃长12毫米，小肠32毫米，直肠13毫米，肝脏继续增大，占腹腔1/3。胆囊在两叶肝之间下端，胆汁清淡而不见颜色，因此幼体
摄食的饵料还不能充分消化，前肢四趾的分化基本完成，但后肢仍为四指。幼体能保持平衡，可在水底作短时的缓慢爬行，体侧的肋沟皮褶有13-15条。
出膜56天后的幼体、体长达49-57毫米，体重1.3-2克，触觉敏锐，但视力差。有畏光特性，虽有外鳃，但用鼻进行呼吸。
幼体生长5个多月后，体两肋沟可见14-16皮褶。背面呈棕黑，腹面呈暗紫红色。心包腔隔膜呈弧形、腹面为肉白色，外鳃三根主枝为红棕色，似绒毛的须状物，呈灰白色。
幼体生长到6个月左右时，开始脱皮，皮透明，幼体约30天脱皮一次。此后幼体的生活习性和特性接近成体，可独立生活。
表4－7 娃娃鱼胚胎发育分期与外部特征
图4——7中国大鲵胚胎发育外形图
a二细胞期; (b) 四细胞期; (c) 八细胞期, 箭头示分裂沟; (d) 多细胞期; (e) 囊胚早期; (f ) 囊胚晚期;(g) 原肠早期顶面观; (h) 原肠早期侧面观(固定后的胚胎) ; (i) 原肠晚期腹面观; (j) 神经板期, NP 示神经板;(k) 神经褶期, 箭头示神经褶; (l) 正在愈合的神经胚尾端, 长箭头示胚孔, 短箭头示神经管; (m) 神经管期,箭头示体节, 短箭头示神经管; (n) 尾芽期, 箭头示突出的尾芽; (o) 鳃板期, 箭头示隆起的鳃板, 短箭头示心脏位置; (p) 前肢芽早期, 箭头示鳃芽, 短箭头示前肢芽; (q) 前肢芽晚期; ( r) , ( s) 鳃血循环期, 黑箭头示外鳃,白箭头示下颌; (t) 尾血循环期, 白箭头示尾血管, 黑箭头示腹部色素; (u) 后肢芽期, 箭头示后肢芽, 短箭头示羽状外鳃
(a) 囊胚期横切切片, BC 示囊胚腔, 箭头示囊胚腔顶壁细胞, 红色区域放大为(b) 图; (b) 囊胚植物半球放大, 箭头示细胞核; (c) 原肠胚早期切片, BC 示囊胚腔, 箭头示背唇, 背唇左侧的空腔是由于卵黄脱落造成的假象, 并非原肠腔,红色区域放大为(d) 图; (d) 原肠胚背唇, 箭头示细胞核; (e) 原肠胚晚期纵切切片, 箭头示背唇; (f ) 神经板期横切,箭头示神经板; (g) 神经板细胞放大, 短箭头示细胞核, 箭头示卵黄颗粒; (h) 神经褶期横切切片; (i) 神经褶部位放大图, N 示细胞核, 箭头示卵黄颗粒; (j) 神经管期头部纵切切片, 箭头示眼泡, FB 示前脑, HB 示后脑; (k) 神经管期胸部横切切片, 箭头示体节, 短箭头示实心的脊索, NT 示神经管, P 示咽; (l) 神经管期腹部横切切片, 箭头示脊索, I 示肠; (m) 尾芽期胸部横切切片, H 示心脏原基; (n) 鳃板期头部横切切片, 箭头示鳃板, 短箭头示脊索; (o) 鳃板期胸部横切切片, 箭头示心房心室
(a)前肢芽期头部纵切切片, RB 示菱脑, 箭头示嗅窝, 短箭头示视杯及晶状体; ( b) 前肢芽头部横切切片, AV 示听囊,短箭头示脑神经, 可见空泡化的脊索; (c) 前肢芽胸部横切切片, TG示甲状腺, P 示咽, BB 示鳃芽; (d) 前肢芽胸部横切切片, 箭头示心脏, 短箭头示鳃芽, I 示肠; (e) 前肢芽腹部横切切片, L 示肝; (f ) 前肢芽腹部横切切片, 箭头示神经嵴,短箭头示肾管, FL 示前肢芽; (g) 前肢芽期腹部富含卵黄组织切片, 箭头示细胞核, 短箭头示卵黄颗粒; ( h) 鳃血循环期头部纵切切片; (i) 鳃血循环期胸部横切切片, 箭头示鳃芽及鳃丝, 短箭头示脑神经; (j) 鳃血循环期腹部横切切片, ST 示胃; (k) 尾血循环期头部横切切片, 箭头示透明的晶状体, OP 示嗅窝, RB 示发达的菱脑; (l) 尾血循环期腹部横切切片,L 示肝脏; (m) 后肢期横切切片, 箭头示背部皮肤腺; (n) 后肢芽期后肢芽处横切切片, 箭头示后肢芽; (o) 后肢芽期肛二横切切片, 箭头示肛门
图4——8 中国大鲵胚胎发育组织显微图
图4——9中国大鲵胚胎发育组织显微图
（仿骆 剑 肖亚梅2007）
小结
1、中国大鲵的卵裂方式
中国大鲵卵子受精后形成白色帽状胚盘, 分裂仅限于胚盘, 属于典型的盘状卵裂 . 作者近三年对大鲵早期胚胎的观察发现: 中国大鲵卵子受精后, 并未见明显的胚盘样隆起.受精卵分裂时, 分裂沟自大鲵极端向下延伸至植物球. 在囊胚期的植物半球上可观察到一些浅龟裂状的分裂沟, 这一现象曾有过报道 . 中国大鲵胚胎没有出现卵黄囊结构, 囊胚腔顶壁细胞中含有大量的卵黄, 囊胚腔下方植物半球中可见许多细胞核. 同时, 在神经胚、尾芽期、鳃板期和前肢芽期胚胎的外胚层来源细胞中均存在有丰富的卵黄颗粒. 盘状卵裂类型的分裂沟局限于胚盘, 卵黄不参与胞质的分割 . 观察结果表明, 中国大鲵早期胚胎发育卵裂类型不是盘状卵裂, 而与黑斑蛙、东方蝾螈的不等全裂方式更为相似. 在中国大鲵早期胚胎切片中, 特别在那些卵黄很丰富的组织中, 细胞界限不清晰, 只能观察到大量的细胞核. 我们注意到, 那些卵黄较少的外胚层组织比较容易分辨细胞界限, 而随着卵黄持续消耗, 那些原本分界模糊的内胚层来源的组织其细胞界限也逐渐清晰起来. 然而中国大鲵早期胚胎细胞界限不清晰究竟是因为细胞质中卵黄对细胞结构观察的影响, 抑或是由于丰富卵黄对分裂面的阻遏作用, 导致细胞质的分裂滞后于核分裂, 还需要进一步的深入研究.中国大鲵第一、二次卵裂均为经裂, 第三次卵裂仍为经裂, 第四次卵裂为不规则的纬裂. 这与黑斑蛙与东方蝾螈前两次卵裂是经裂, 第三次卵裂则为纬裂, 第四次分裂是经裂 存在着明显差异.施氏鲟( A ci penser S chrencki i ) 是一种以不等全裂方式进行卵裂的硬骨鱼类, 施氏鲟前三次卵裂为经裂, 第四次为纬裂, 刘洪柏等 认为施氏鲟的这种卵裂方式是介于鱼类和两栖类之间的一种过渡类型. 中国大鲵与施氏鲟早期卵裂过程十分相似, 表明中国大鲵在进化上可能与硬骨鱼类存在有密切关系.在20 ℃水温下, 从受精卵发育至囊胚早期多数硬骨鱼类仅3 h, 黑斑蛙约6 h, 东方蝾螈约24 h , 而中国大鲵则需要约70 h. 中国大鲵早期胚胎细胞分裂速度非常缓慢, 从而导致整个胚胎发育持续时间长(约700 h) . 在中国大鲵人工繁育生产实践中, 控制孵化温度、孵化密度, 提高溶氧量,保持水体清洁和防止微生物侵染是提高中国大鲵孵化率的一个重要保证.
2、中国大鲵在器官发生发育上的特点
中国大鲵在脑的分化, 眼、嗅窝、听囊、肾管和生殖嵴的发生发育过程上与东方蝾螈 基本相同) . 在鳃板期二者都出现了心房心室, 心脏搏动血液循环也都是在前肢芽早期开始的, 但中国大鲵心脏原基的出现要稍稍晚于东方蝾螈. 中国大鲵在消化系统的发生发育上与东方蝾螈存在有较大的差异: 东方蝾螈在神经管期、尾芽期和鳃板期分化出咽、肝脏和甲状腺, 并且形成了肛门; 而中国大鲵在神经管期有咽和肠的形成, 在此之后的较长时间内消化道没有明显发育变化, 直到前肢芽期才形成肝脏和甲状腺, 孵化期出现肛门. 中国大鲵胚胎消化系统发育缓慢的特点可能与其胚胎细胞含有丰富的卵黄密切相关. 孵化出膜中国大鲵幼苗的组织细胞中仍然含有大量卵黄,这些卵黄的存在为胚后发育提供营养. 大鲵幼苗细胞中的卵黄大约在孵化出膜后30 d 左右消耗殆尽, 此时消化系统也已基本发育完善, 方可开始投喂饵料. 刚孵化的大鲵幼苗虽然已经开口、具有吞咽食物的能力, 但若立即喂食, 则会导致幼苗死亡.大多数两栖大鲵胚胎孵化后在其头部发生一类临时性的器官: 东方蝾螈为平衡器 , 无尾类为口吸盘. 平衡器为棒状突起. 一般认为平衡器的存在可以帮助幼苗在水中保持平衡; 口吸盘则通过分泌糖蛋白粘液, 使蝌蚪粘附于水中的物体上 . 在中国大鲵幼苗中并未观察到有平衡器或口吸盘的出现. 东方蝾螈幼苗体长约1. 2 cm, 黑斑蛙幼苗约1. 1 cm , 体型均较小, 在水体中需要依靠平衡器或口吸盘来维持身体平衡和稳定. 中国大鲵孵化时体长约3. 5 cm , 腹部呈勺状, 体型较大, 幼苗可以借助于一对长达1 cm 的发达外鳃来保持身体平衡作者认为平衡棒和口吸盘这类临时性器官的缺失可能与中国大鲵的自身发育特点相适应.
一、变态变化
娃娃鱼个体发育的一个重要特征是变态，即具有发育的双重系统。这说明娃娃鱼个体发育是有两套有效基因型同时存在于娃娃鱼基因组中，其中一个是卵子和幼虫基因型，另一个是成体基因型。
从演化的角度来看，娃娃鱼变态尽管有两个基因型作为遗传依据，但其卵子和幼体却具有鱼类一般特性，很少新的演化内容。娃娃鱼从受精卵到幼体期间的个体发育，一系列变态形成程序都是按祖体模式进行。许多成体器官，实际上大都是相同幼体器官基础之上经改建而成。
娃娃鱼变态中的形态改变特点，是由有尾幼体形态过渡为幼体的形态，其变态变化均有较多经历。幼体形态早在孵化期之前已经出现，幼体孵化后主要是加速生长，很少外形变化，此一时期称幼体生长期或变态前幼体期（premetamorphic period）。历时长短，受遗传基因决定，同时已受生态环境影响。幼体由生长期进入变态后，其开始阶段称为变态初期。实际上，这也是变态中的一个生长期。在此期间，四肢先后生出，其中前肢的生出早于后肢。幼体生出四肢后，变态进入顶峰期（metamorphic climax）。其主要特征是外鳃退化和体转扁平。
二、 变态的激素调控
娃娃鱼变态直接受甲状腺激素控制。此激素的分泌具有程序化格式，一方面对成体器官的新生起促进作用，另一方面对幼体器官的退化起促进作用。因此，变态是按程序格式有顺序地进行。
甲状腺素在化学组成上是一种三碘甲状腺氨酸（简写为T3）、四碘甲状腺氨酸（简写为T4）的混合物，其中，前者对变态起主要作用。
甲状腺素及其来源器官（甲状腺）作为个体发育中的产物，不论在形态上或生理上都有从低级到高级的过程。正是在此过程中，垂体对甲状腺有影响或制约作用。对甲状腺起此作用的垂体激素称为促甲状腺素（TSH）。在幼体生长期，甲状腺在TSH影响下不断增加分泌量，但浓度始终达不到使幼体进入变态变化所需水平，原因是垂体在分泌TSH的同时还分泌促乳激素，后者在激发幼体身体长大同时却又抑制甲状腺的活动程度。娃娃鱼变态过程，实即甲状腺受垂体和下丘脑的间接控制，抑制和反抑制之下不断出现新平衡的过程。
两栖类大鲵变态是个体发育上一个重要特征。但娃娃鱼与蛙类的变态有着不同的发育学上的特点。
蛙类是先分化出后肢，娃娃鱼则是先分化出前肢。娃娃鱼皮肤组织在变态完成后进一步变化，其内容是：①表皮细胞增加，以致整个皮肤变厚；②通过多细胞腺体的增加和分泌，皮肤表面变得光滑、湿润；③由于不同色素细胞增加和重新排列，皮肤的疣瘤和斑纹逐渐进入成体模式；④娃娃鱼变态没有尾的吸收，保持尾的运动，更适应水中生活。
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