“ 学 术 研 究 碱性蛋 白酶 与木瓜 蛋 白酶 协 同水解大豆蛋 自的研 究 董 翠 翠 (新疆阿勒泰畜牧兽 医职业学校 新疆阿勒泰 836500) 摘 要 :利 用碱 性 蛋 白酶 和木 瓜 蛋 白酶 分 别 水 解 大豆 蛋 白 ,制 备 具 大豆 多肽 ,通过 正 交 优 化 试 验 确 定 碱 性 蛋 白酶 与 木 瓜 蛋 白 酶 协 同水 解的最佳水解 条件 ,考察底物 浓度 、反 应 时间、反应 温度 、PH值与碱性 蛋 白酶 与木瓜蛋 白酶协 同水解 大豆蛋 白的影 响 ,为 更 好 地 利 用 大 豆 蛋 白奠 定 基 础 。 关 键 词 :碱 性 蛋 白酶 木 瓜 蛋 白酶 协 同水 解 大豆 蛋 白 中图 分 类 号 :R84 文献标识码 :A 文章 编号:1672.5336(2014)10—0085—03 1引言 蛋 白酶 水解 —呻 灭酶(90℃ 1Omin) 调 酸 1.1研 究 意义 与 目的 (pH4.5)一 离 I ̄,(4000转 10min) 本实验 以大 豆蛋 白为酶解 底 物 ,选择 工 业用 酶一 2材料 与 方法 碱 性 蛋 白酶 和 常 用 的 木瓜 蛋 白酶 进 行 深 度 水 解 ,引 入 正 交 试 验 设 计 方 法 ,借 助 数 学 模 型 统 计 分析 获得 较 高 水 解 度 的 综 合 方 案 ,探 讨 制 备 小 分 子 大 豆 肽 的 2.1实验材 料 碱性蛋 白酶2.4L:食 品级 ,酶 活力2.4AU/g,丹麦 最 佳 工艺 ,为开 发 功 能性大 豆 蛋 白 ,拓宽 其 应用 领 域 NOVO公司出 品;木瓜蛋 白酶 :食 品级 ,酶活力2000U/ 奠 定 基 础 。 g,西安Wolsen公司出品 ;低温脱脂豆粕 :含水量 7.9%, 1.2技 术路 线 实验 技术 路 线如 下 : 蛋 白质含量51.49% ,脂肪含 量0.86%,山东万德福 。 2。2主要 仪 器和 设备 豆粕(粉碎) 加水调浆 — 水浴 (90 ̄C 10min) 水浴锅 :DK一98— 1型 ,天津市 泰斯 特仪器有 限公 水浴 搅拌调pH 司 ;pH计 :pHSJ一4A,上海精密科学仪器有 限公司 ;精密 表 2酶组合实验表 实验组 实验号 l 2 3 酶 组 合 碱 性蛋 白酶 木 瓜蛋 白酶 碱 性蛋 白酶/木瓜蛋 白酶 [S](%) 5.5 T(E) 60 55 PH 8.5 6.7 8.5/6.7 四 五 4 5 6 7 8 9 l0 l1 l2 l3 木 瓜蛋 白酶/碱性蛋 白酶 碱 性蛋 白酶/木瓜蛋 白酶 木 瓜蛋 白酶/碱性蛋 白酶 双 酶协同水解 碱 性蛋 白酶/木瓜蛋 白酶 木 瓜蛋 白酶/碱性蛋 白酶 双 酶协同水解 碱 性蛋 白酶/木瓜蛋 白酶 木 瓜蛋 白酶 性蛋 白酶 双 酶协同水解 6.7/8.5 6.7 7.5 8.5 说 明 :碱性 蛋 白酶/木瓜 蛋 白酶代表 碱性蛋 白酶先水 解4h,再 加入 木瓜 蛋 白酶后水 解2h; 双酶 协 同水解 代表碱性 蛋 白酶和 木瓜蛋 白酶 一起 水解 5h; 8.5/6.7代表pH先调至8.5N-调 至6.7。 实验号 耗碱量 DH(%) 实验 号 耗碱量 DH(%) 1 4.917 22.27 8 5.219 23.64 2 2.301 1O.42 9 5.208 23.59 表 3酶 组合 水 解 实 验 结 果 3 5.108 23.14 1O 5.276 23.9O 4 5.007 22.68 1l 6.774 30.69 5 5.117 23.18 l2 6.689 30.3O 6 5.112 23.16 l3 6.887 31.20 7 5.201 23.56 作者简介:董翠翠(1986年 7月),学历:本科 ,研究方向:畜产品加 工,单位:新疆阿勒泰 畜牧兽 医职业学校 。 中外食 品工业 Sier —foreign Food Industry 85 学术研 究 \’ 1 !苎 2r.业 表 4因 素水 平表 将大 豆蛋 白酶 解液加 热升温 至90℃,保 温 1 0min 因 素 使酶 活力丧失 。冷 却至室温后取酶 解液调 节pH至 大豆 水平 l 2 3 A DH 7.5 8 8.5 B T(℃) 50 55 60 C【s](%) 5 5.5 6 表5正交试验表 (3 ) D 空列 l 2 3 蛋 白等 电点(pH4.5)后取一部分酶 解液在4。c静置6— 24h,以备观 察其 沉 淀情 况 。另一部 分 通过 离 心机在 4000r/arin,离,t ̄,10arin,制得 上清液和沉 淀。 (2)水解 产物的测定 。 1)沉淀 的测 定 。把 离心 后的部 分沉 淀(m1)称量 后 实验号 1 2 3 4 A 7.5 7.5 7.5 8.0 因 素 B C 50 55 60 5.0 5.5 6.0 50 5.5 D 1 2 、 3 3 指标 DH(%) 26.67 23.9O 22 74 .23.82 放入 烘干箱 (65℃)内干燥 3h后冷 却至 室温 ,取 出称 重 后 ,再 按 以上方 法进 行复 烘 ,每 隔30min取 出冷 却称 重 一次 ,烘至 前后 两次 重量差 不超过 0.005g为止 ,平 行 试验三 个 。把干燥 物取 出 ,称量 离心 管(m,)至恒重 , 记 录 数据 。 5 6 7 8 9 毛 8.O 55 6.0 1 24.22 8.0 60 5.O 2 28.14 8.5 8.5 50 55 6.0 5.0 2 3 28.11 36.30 8.5 60 5.5 1 31.28 73.31 78.60 91.11 82.17 ∑=245.18 k2 76.18 84.42 79.0O 80.15 2)上 清液 的测 定 。测定离 心后酶 解 液的上 清 液体 积 (v),倒 出上清液 测量 体积并置 于4℃冷 藏保存 ,用凯 式 定氮法 测 定蛋 白质 含量 。 2.3.3 统计研 究方 法一 正 交试 验 设 计 法 在碱 性蛋 白酶 和木 瓜蛋 白酶 水解 大豆 蛋 白时 ,其 水解度 会随着pH值 、水解 温度(T)、底物 浓度([s])等 因 素 的变化会有 所不 同【21。确 定三 因素 的取值水 平范 围 , 95.69 82.16 75.O7 22.86 以水 解度 (DH)为指标 ,选用三 因素三水平 实行正交试 —— 1 k—— 2 24.44 26.20 30.37 27.39 25.39 28.14 26.33 26.72 —尼— 3 31.90 27.39 25.02 27.62 验设 计方 案进 行 研究 。 3结果 与讨 论 3.1碱性蛋 白酶与木瓜蛋白酶协同水解条件的考察 3.1.1水解 顺序 的 分析 7.46 1.94 5.35 0.90 根据表2做 的实验结果 如表 3。 结 合表2和试验 结果表 3可知 ,实验 组三 、四、五 的 增力 电动搅拌器 :JJ一 1,常周 国华 电器有 限公司 ;自动 DH要 大 于实验 组一 、二 的DH ,说 明了双酶 水解 的水 电位滴定仪 :ZDJ一4 A,上海精密科学仪器有 限公司 。 解程 度要 大 于单酶 水解 的水 解程 度 。DH 7>DH 5> 2.3试 验 方 法 DH6、DH10>DH8>DH9、DH1 3>DHl1>DH12,说 2.3.1水 解 条件 的研 究 明在 同温 同pH 同底物 浓度 下 ,双酶 同时水 解 的水解 (1)大 豆蛋 白的酶解反 应。1)大豆蛋 白预处理 。豆粕 程度要 大于双 酶前后水解 的水解程 度 。DH1 3>DHl0 粉碎 后加水调 浆制成 各浓度 大豆蛋 白溶液 ,在90℃温 >DH7>DH3>DH4,说 明在 同温 同底物 浓度 下 ,不 同 度 下恒 温水浴 1 0min。2)大豆蛋 白的酶解操作 。称取豆 pH的双酶 同 时水 解 的最小水 解程度 仍然 大于双 酶单 粕粉 加入 适量水 配制成 为一定 浓度 的大豆 蛋 白溶 液 , 独水 解最 佳P H情 况下进 行 的前 后水 解 的程 度 。可 以 经 恒 温 水 浴 预 处 理 后 ,调 节 温 度 至 反 应 温 度 搅 拌 得 出结 论 ,双 酶 同时作 用水解 要 比双 酶前后 作用 水解 20arin,调 节pH值 至反应值 ,加入一 定 比例蛋 白酶 ,在 程 度 大 。 反应 温度 下进行 恒温酶 解 ,酶解过 程 中需要 不断进行 3.1.2正 交试验 确 定最 佳 水 解条 件 搅拌 ,同时通过滴 加1N的NaOH溶液 以保持反 应体系 结 合酶 组合 的考虑 和 各 因素 间的相 互依 赖 、相互 pH值恒定 ,反应偏差 一般控制在 ±0.1。记录NaOH溶 制约 ,进行 正交试验 以确定各 参数 的最佳组 合 即酶解 液的滴加量 ,利用pH-stat法计算水 解度 。 大豆蛋 白的最 佳水解 条件 。这 里用正 交表 f3 1,以水 (2)酶组 合顺 序 的考察 。在 酶 催化水 解 反应 中,以 解度(DH%)为测定 指标 ,双 酶 同时水 解 ,拟定 出试验 pH值 、温度 、底 物浓度 、酶 用量对 反应 速度 影响 较大 , 方 案表 来 考 察 三 个 因素 对 水 解 的 影 响 ,水解 时 间为 而酶用 量是针对 溶 液 中蛋 白质 的含量 ,与底 物 浓度成 5h。因素分析表如 表4。 正 比关系 ,因此只 需 确定 适 当的pH值 、温 度 、底物 浓 正 交试验表 如表5。 度 【I]。碱性 蛋 白酶 最佳水 解条件 :pH8.5,60 ̄C,[s]6%, 由正 交试验 结果表 5看 出,空YJ'R的值小于 其它各 酶用量 6.0,木瓜 蛋 白酶 最佳 水解条件 :pH6.7,55℃ , 因素的 的R,可 以判 定个实验 因素 的效 应R是可靠 的。 【S]5%,酶用量 0.51121。 极 值R越 大 ,则 表示 因素 的水 平变化 对 实验 的影响 越 因此 结合 碱 性 蛋 白酶 和 木
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