“ 学 术 研 究 碱性蛋 白酶 与木瓜 蛋 白酶 协 同水解大豆蛋 自的研 究 董 翠 翠 （新疆阿勒泰畜牧兽 医职业学校 新疆阿勒泰 ８３６５００） 摘 要 ：利 用碱 性 蛋 白酶 和木 瓜 蛋 白酶 分 别 水 解 大豆 蛋 白 ，制 备 具 大豆 多肽 ，通过 正 交 优 化 试 验 确 定 碱 性 蛋 白酶 与 木 瓜 蛋 白 酶 协 同水 解的最佳水解 条件 ，考察底物 浓度 、反 应 时间、反应 温度 、ＰＨ值与碱性 蛋 白酶 与木瓜蛋 白酶协 同水解 大豆蛋 白的影 响 ，为 更 好 地 利 用 大 豆 蛋 白奠 定 基 础 。 关 键 词 ：碱 性 蛋 白酶 木 瓜 蛋 白酶 协 同水 解 大豆 蛋 白 中图 分 类 号 ：Ｒ８４ 文献标识码 ：Ａ 文章 编号：１６７２．５３３６（２０１４）１０—００８５—０３ １引言 蛋 白酶 水解 —呻 灭酶（９０℃ １Ｏｍｉｎ） 调 酸 １．１研 究 意义 与 目的 （ｐＨ４．５）一 离 Ｉ￣，（４０００转 １０ｍｉｎ） 本实验 以大 豆蛋 白为酶解 底 物 ，选择 工 业用 酶一 ２材料 与 方法 碱 性 蛋 白酶 和 常 用 的 木瓜 蛋 白酶 进 行 深 度 水 解 ，引 入 正 交 试 验 设 计 方 法 ，借 助 数 学 模 型 统 计 分析 获得 较 高 水 解 度 的 综 合 方 案 ，探 讨 制 备 小 分 子 大 豆 肽 的 ２．１实验材 料 碱性蛋 白酶２．４Ｌ：食 品级 ，酶 活力２．４ＡＵ／ｇ，丹麦 最 佳 工艺 ，为开 发 功 能性大 豆 蛋 白 ，拓宽 其 应用 领 域 ＮＯＶＯ公司出 品；木瓜蛋 白酶 ：食 品级 ，酶活力２０００Ｕ／ 奠 定 基 础 。 ｇ，西安Ｗｏｌｓｅｎ公司出品 ；低温脱脂豆粕 ：含水量 ７．９％， １．２技 术路 线 实验 技术 路 线如 下 ： 蛋 白质含量５１．４９％ ，脂肪含 量０．８６％，山东万德福 。 ２。２主要 仪 器和 设备 豆粕（粉碎） 加水调浆 — 水浴 （９０￣Ｃ １０ｍｉｎ） 水浴锅 ：ＤＫ一９８— １型 ，天津市 泰斯 特仪器有 限公 水浴 搅拌调ｐＨ 司 ；ｐＨ计 ：ｐＨＳＪ一４Ａ，上海精密科学仪器有 限公司 ；精密 表 ２酶组合实验表 实验组 实验号 ｌ ２ ３ 酶 组 合 碱 性蛋 白酶 木 瓜蛋 白酶 碱 性蛋 白酶／木瓜蛋 白酶 ［Ｓ］（％） ５．５ Ｔ（Ｅ） ６０ ５５ ＰＨ ８．５ ６．７ ８．５／６．７ 四 五 ４ ５ ６ ７ ８ ９ ｌ０ ｌ１ ｌ２ ｌ３ 木 瓜蛋 白酶／碱性蛋 白酶 碱 性蛋 白酶／木瓜蛋 白酶 木 瓜蛋 白酶／碱性蛋 白酶 双 酶协同水解 碱 性蛋 白酶／木瓜蛋 白酶 木 瓜蛋 白酶／碱性蛋 白酶 双 酶协同水解 碱 性蛋 白酶／木瓜蛋 白酶 木 瓜蛋 白酶 性蛋 白酶 双 酶协同水解 ６．７／８．５ ６．７ ７．５ ８．５ 说 明 ：碱性 蛋 白酶／木瓜 蛋 白酶代表 碱性蛋 白酶先水 解４ｈ，再 加入 木瓜 蛋 白酶后水 解２ｈ； 双酶 协 同水解 代表碱性 蛋 白酶和 木瓜蛋 白酶 一起 水解 ５ｈ； ８．５／６．７代表ｐＨ先调至８．５Ｎ－调 至６．７。 实验号 耗碱量 ＤＨ（％） 实验 号 耗碱量 ＤＨ（％） １ ４．９１７ ２２．２７ ８ ５．２１９ ２３．６４ ２ ２．３０１ １Ｏ．４２ ９ ５．２０８ ２３．５９ 表 ３酶 组合 水 解 实 验 结 果 ３ ５．１０８ ２３．１４ １Ｏ ５．２７６ ２３．９Ｏ ４ ５．００７ ２２．６８ １ｌ ６．７７４ ３０．６９ ５ ５．１１７ ２３．１８ ｌ２ ６．６８９ ３０．３Ｏ ６ ５．１１２ ２３．１６ ｌ３ ６．８８７ ３１．２０ ７ ５．２０１ ２３．５６ 作者简介：董翠翠（１９８６年 ７月），学历：本科 ，研究方向：畜产品加 工，单位：新疆阿勒泰 畜牧兽 医职业学校 。 中外食 品工业 Ｓｉｅｒ —ｆｏｒｅｉｇｎ Ｆｏｏｄ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ ８５ 学术研 究 ＼’ １ ！苎 ２ｒ．业 表 ４因 素水 平表 将大 豆蛋 白酶 解液加 热升温 至９０℃，保 温 １ ０ｍｉｎ 因 素 使酶 活力丧失 。冷 却至室温后取酶 解液调 节ｐＨ至 大豆 水平 ｌ ２ ３ Ａ ＤＨ ７．５ ８ ８．５ Ｂ Ｔ（℃） ５０ ５５ ６０ Ｃ【ｓ］（％） ５ ５．５ ６ 表５正交试验表 （３ ） Ｄ 空列 ｌ ２ ３ 蛋 白等 电点（ｐＨ４．５）后取一部分酶 解液在４。ｃ静置６— ２４ｈ，以备观 察其 沉 淀情 况 。另一部 分 通过 离 心机在 ４０００ｒ／ａｒｉｎ，离，ｔ￣，１０ａｒｉｎ，制得 上清液和沉 淀。 （２）水解 产物的测定 。 １）沉淀 的测 定 。把 离心 后的部 分沉 淀（ｍ１）称量 后 实验号 １ ２ ３ ４ Ａ ７．５ ７．５ ７．５ ８．０ 因 素 Ｂ Ｃ ５０ ５５ ６０ ５．０ ５．５ ６．０ ５０ ５．５ Ｄ １ ２ 、 ３ ３ 指标 ＤＨ（％） ２６．６７ ２３．９Ｏ ２２ ７４ ．２３．８２ 放入 烘干箱 （６５℃）内干燥 ３ｈ后冷 却至 室温 ，取 出称 重 后 ，再 按 以上方 法进 行复 烘 ，每 隔３０ｍｉｎ取 出冷 却称 重 一次 ，烘至 前后 两次 重量差 不超过 ０．００５ｇ为止 ，平 行 试验三 个 。把干燥 物取 出 ，称量 离心 管（ｍ，）至恒重 ， 记 录 数据 。 ５ ６ ７ ８ ９ 毛 ８．Ｏ ５５ ６．０ １ ２４．２２ ８．０ ６０ ５．Ｏ ２ ２８．１４ ８．５ ８．５ ５０ ５５ ６．０ ５．０ ２ ３ ２８．１１ ３６．３０ ８．５ ６０ ５．５ １ ３１．２８ ７３．３１ ７８．６０ ９１．１１ ８２．１７ ∑＝２４５．１８ ｋ２ ７６．１８ ８４．４２ ７９．０Ｏ ８０．１５ ２）上 清液 的测 定 。测定离 心后酶 解 液的上 清 液体 积 （ｖ），倒 出上清液 测量 体积并置 于４℃冷 藏保存 ，用凯 式 定氮法 测 定蛋 白质 含量 。 ２．３．３ 统计研 究方 法一 正 交试 验 设 计 法 在碱 性蛋 白酶 和木 瓜蛋 白酶 水解 大豆 蛋 白时 ，其 水解度 会随着ｐＨ值 、水解 温度（Ｔ）、底物 浓度（［ｓ］）等 因 素 的变化会有 所不 同【２１。确 定三 因素 的取值水 平范 围 ， ９５．６９ ８２．１６ ７５．Ｏ７ ２２．８６ 以水 解度 （ＤＨ）为指标 ，选用三 因素三水平 实行正交试 —— １ ｋ—— ２ ２４．４４ ２６．２０ ３０．３７ ２７．３９ ２５．３９ ２８．１４ ２６．３３ ２６．７２ —尼— ３ ３１．９０ ２７．３９ ２５．０２ ２７．６２ 验设 计方 案进 行 研究 。 ３结果 与讨 论 ３．１碱性蛋 白酶与木瓜蛋白酶协同水解条件的考察 ３．１．１水解 顺序 的 分析 ７．４６ １．９４ ５．３５ ０．９０ 根据表２做 的实验结果 如表 ３。 结 合表２和试验 结果表 ３可知 ，实验 组三 、四、五 的 增力 电动搅拌器 ：ＪＪ一 １，常周 国华 电器有 限公司 ；自动 ＤＨ要 大 于实验 组一 、二 的ＤＨ ，说 明了双酶 水解 的水 电位滴定仪 ：ＺＤＪ一４ Ａ，上海精密科学仪器有 限公司 。 解程 度要 大 于单酶 水解 的水 解程 度 。ＤＨ ７＞ＤＨ ５＞ ２．３试 验 方 法 ＤＨ６、ＤＨ１０＞ＤＨ８＞ＤＨ９、ＤＨ１ ３＞ＤＨｌ１＞ＤＨ１２，说 ２．３．１水 解 条件 的研 究 明在 同温 同ｐＨ 同底物 浓度 下 ，双酶 同时水 解 的水解 （１）大 豆蛋 白的酶解反 应。１）大豆蛋 白预处理 。豆粕 程度要 大于双 酶前后水解 的水解程 度 。ＤＨ１ ３＞ＤＨｌ０ 粉碎 后加水调 浆制成 各浓度 大豆蛋 白溶液 ，在９０℃温 ＞ＤＨ７＞ＤＨ３＞ＤＨ４，说 明在 同温 同底物 浓度 下 ，不 同 度 下恒 温水浴 １ ０ｍｉｎ。２）大豆蛋 白的酶解操作 。称取豆 ｐＨ的双酶 同 时水 解 的最小水 解程度 仍然 大于双 酶单 粕粉 加入 适量水 配制成 为一定 浓度 的大豆 蛋 白溶 液 ， 独水 解最 佳Ｐ Ｈ情 况下进 行 的前 后水 解 的程 度 。可 以 经 恒 温 水 浴 预 处 理 后 ，调 节 温 度 至 反 应 温 度 搅 拌 得 出结 论 ，双 酶 同时作 用水解 要 比双 酶前后 作用 水解 ２０ａｒｉｎ，调 节ｐＨ值 至反应值 ，加入一 定 比例蛋 白酶 ，在 程 度 大 。 反应 温度 下进行 恒温酶 解 ，酶解过 程 中需要 不断进行 ３．１．２正 交试验 确 定最 佳 水 解条 件 搅拌 ，同时通过滴 加１Ｎ的ＮａＯＨ溶液 以保持反 应体系 结 合酶 组合 的考虑 和 各 因素 间的相 互依 赖 、相互 ｐＨ值恒定 ，反应偏差 一般控制在 ±０．１。记录ＮａＯＨ溶 制约 ，进行 正交试验 以确定各 参数 的最佳组 合 即酶解 液的滴加量 ，利用ｐＨ－ｓｔａｔ法计算水 解度 。 大豆蛋 白的最 佳水解 条件 。这 里用正 交表 ｆ３ １，以水 （２）酶组 合顺 序 的考察 。在 酶 催化水 解 反应 中，以 解度（ＤＨ％）为测定 指标 ，双 酶 同时水 解 ，拟定 出试验 ｐＨ值 、温度 、底 物浓度 、酶 用量对 反应 速度 影响 较大 ， 方 案表 来 考 察 三 个 因素 对 水 解 的 影 响 ，水解 时 间为 而酶用 量是针对 溶 液 中蛋 白质 的含量 ，与底 物 浓度成 ５ｈ。因素分析表如 表４。 正 比关系 ，因此只 需 确定 适 当的ｐＨ值 、温 度 、底物 浓 正 交试验表 如表５。 度 【Ｉ］。碱性 蛋 白酶 最佳水 解条件 ：ｐＨ８．５，６０￣Ｃ，［ｓ］６％， 由正 交试验 结果表 ５看 出，空ＹＪ＇Ｒ的值小于 其它各 酶用量 ６．０，木瓜 蛋 白酶 最佳 水解条件 ：ｐＨ６．７，５５℃ ， 因素的 的Ｒ，可 以判 定个实验 因素 的效 应Ｒ是可靠 的。 【Ｓ］５％，酶用量 ０．５１１２１。 极 值Ｒ越 大 ，则 表示 因素 的水 平变化 对 实验 的影响 越 因此 结合 碱 性 蛋 白酶 和 木
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