乳腺癌是女性中发病率最高的一种癌症。尽管预防、诊断以及治疗上都有了极大的提高，但在女性肿瘤死亡率中仍排在前列。目前临床上，乳腺癌根据雌激素受体 (ER)、孕激素 (PR) 和人表皮生长因子受体2 (HER2) 表达情况，分成：Luminal A，Luminal B，HER2和三阴性乳腺癌（TripleNegative Breast Cancer, TNBC）等四种亚型，其中三阴性乳腺癌占15%左右。三阴性乳腺癌由于其具有很强的侵袭性和缺少可以靶向的药物，且具有非常高的异质性，是所有乳腺癌类型中预后最差的一种。
肿瘤干细胞也被称作肿瘤起始细胞，是肿瘤中一群具有自我更新能力并能产生异质性肿瘤细胞的一类细胞群。目前临床上常用的治疗方式对肿瘤干细胞不仅不能起到很好的杀伤效果，反而一定程度上富集了肿瘤干细胞，进而造成耐药和复发。三阴性乳腺癌中富含肿瘤干细胞，因此对三阴性乳腺癌干细胞进行深入研究，发现有效的靶向药物，才能很好地控制三阴性乳腺癌的发生发展。
近日，国际学术权威刊物自然出版集团旗下子刊《Cell?Discovery》杂志在线发表了中国科学院昆明动物研究所肿瘤生物学学科组陈策实研究组的一篇研究论文，研究报道了二甲双胍抑制三阴乳腺癌干细胞新机制。博士生时培果是本文第一作者，陈策实研究员是本文通讯作者。
1. 二甲双胍抑制TNBC干细胞
为了研究二甲双胍是否可以在TNBC起源的细胞系中减少TNBC干细胞的百分比，作者检测了乳腺癌干细胞生物标志物ALDH (aldehyde dehydrogenase)的表达情况。结果发现在TNBC细胞系HCC1806和HCC1937中二甲双胍会减少肿瘤干细胞的比例（Fig. 1a,b）。
微球体形成实验表明，二甲双胍同样会明显减少上述两株细胞系形成的微球体数量，这进一步证实了上述结果（Fig. 1c,d）。
有限稀释体内成瘤实验是检测肿瘤干细胞的金标准。如Fig.1e所示，无论是Control还是二甲双胍组，1×106的HCC1806细胞裸鼠中可以100%成瘤；当只种植1×105个细胞时，Control组成瘤比例没有变化，但是二甲双胍组降至71.4%；当只种植1000个细胞时，Control组成瘤比例变为87.5%，二甲双胍组降为44.4%。另外，二甲双胍增加了小鼠的存活率、减小了肿瘤的体积和重量（Fig. 1f-i）。
2. 二甲双胍通过抑制KLF5来抑制TNBC干细胞
KLF5是基底型乳腺癌的一种重要转录因子。WB结果显示，在HCC1937和HCC1806细胞系中，二甲双胍可以显著下调KLF5及其下游靶基因FGF-BP1和Nanog的表达水平（Fig.2a）。Nanog已被研究证实在维持干性方面有着重要作用。
当作者在HCC1937细胞中过表达KLF5时，二甲双胍引起的肿瘤干细胞减少可以部分的被挽救回来（Fig. 2b-d）。
作者又使用HCC1086细胞构建了KLF5敲减的稳定株，并进行了有限稀释体内成瘤实验，结果发现，当种植1×106和2×105个细胞时，Control组还是100%可以成瘤，但是KLF5敲减组只有75%和50%的成瘤比例。而当种植2×104和2×103个细胞时，Control组成瘤比例分别为62.5%和37.5%，而KLF5敲减组则无法成瘤（Fig. 2f）。以上结果表明，二甲双胍部分通过抑制KLF5来抑制TNBC干细胞。
3. 二甲双胍降低了KLF5蛋白的稳定性
为了探索在TNBC细胞中二甲双胍减少KLF5表达的机制，作者检测了KLF5的mRNA水平变化。结果发现，在HCC1806和HCC1937细胞中，二甲双胍并没有减少KLF5的mRNA，不过二甲双胍明显降低了KLF5靶基因FGF-BP1的mRNA水平（Fig. 3a,b）。
作者之后进行了环己酰亚胺追踪检测（cycloheximide chase experiment）实验检测了KLF5蛋白的半衰期。与阴性对照相比，20 mM的二甲双胍即可明显增加KLF5的降解速度（Fig. 3c-f）。另外，蛋白酶体抑制剂MG132可以阻止二甲双胍诱导的KLF5的减少（Fig. 3g,h）。
4. 二甲双胍通过抑制PKA来下调KLF5的表达
作者进一步探索了二甲双胍降低KLF5蛋白稳定性的机制。已知二甲双胍可以增加AMP的积累，从而抑制了cAMP的产生以及PKA的活性。事实上二甲双胍也可以在HCC1937细胞中抑制PKA活性和KLF5蛋白水平。作者主要通过检测CREB的磷酸化来测定PKA的活性，CREB是PKA下游的经典底物（Fig. 4a）。而PKA的两个激活剂forskolin和8-Br-cAMP则可以显著增加KLF5的蛋白水平（Fig. 4b）。另外，作者还证实forskolin和8-Br-cAMP均无法增加KLF5的mRNA水平，但是它们可以上调FGF-BP1的mRNA水平（Fig. 4c）。
为了进一步证明PKA可以正调控KLF5的蛋白稳定性，作者又通过siRNA敲低了PKA催化亚基（PKAc）的表达水平，结果发现KLF5 mRNA水平没有明显变化（Fig. 4d）。然而KLF5的蛋白水平却降低了。MG132同样可以阻止由于PKA敲减引起的KLF5下调（Fig. 4e）。
5. 二甲双胍和PKA通过GSK3β调控KLF5蛋白
PKA可以磷酸化GSK3β的S9位点，从而失活GSK3β。而作者之前的研究表明GSK3β可以直接磷酸化KLF5的S303位点，KLF5磷酸化后会被SCFFbw7 E3泛素连接酶泛素化从而被26S蛋白酶体降解。为了研究在TNBC中甲双胍诱导的KLF5降解是否是由GSK3β介导，作者又在二甲双胍处理的HCC1937细胞中检测了p-GSK3β(S9)水平的变化，结果发现，20 μM的二甲双胍即可明显降低p-GSK3β(S9)的水平，与p-CREB(S133)水平变化一致（Fig. 5a）。当删除GSK3β时，二甲双胍无法下调KLF5（Fig. 5b）。GSK3β本身的敲低反而会增加KLF5的蛋白水平，这也与之前的结果是一致的。
既然GSK3β可以直接磷酸化KLF5的S303位点并引起它的降解，于是作者推测二甲双胍是否可以增加KLF5的磷酸化。正如所料，用二甲双胍处理2 h即可降低PKA的活性和增加了GSK3β的活性。另外，二甲双胍处理4 h后p-KLF5(S303)增加了，而6 h后总的KLF5蛋白水平降低了（Fig. 5c）。在HCC1937细胞中，PKA激活剂会增加p-GSK3β的水平而降低p-KLF5(S303)的水平（Fig. 5d）。当删除GSK3β时，forskolin再也无法增加KLF5的蛋白水平。当然，敲低GSK3β同业昂可以下调p-KLF5(S303)的水平（Fig. 5e）。
6. 在人TNBC中PKA活性、p-GSK3β和FGF-BP1与KLF5的表达成正相关
最后，作者在临床样本中检测了上述指标，发现在TNBC病人中PKA-GSK3β-KLF5信号通路被明显激活。最后作者总结了二甲双胍抑制TNBC干细胞的机制图。（Fig. 6）
思路总结
本文的思路总结一下就是经典的ABCD研究模式：A（二甲双胍）通过B（抑制KLF5）在C（TNBC）中起到D（抑制干性）功能。同样应用到你的课题的时候A可以是某个基因、某个LncRNA/miRNA/circRNA等，而B可以是任何相关的基因或者通路。而本文所涉及到的实验也都很经典：WB、Knockdown、Rescue、裸鼠成瘤、免疫组化等。这些实验基本上就是研究此模式类课题的经典实验方法。
参考文献（后台回复“JC40”下载原文）：
1 Shi P, Liu W, Tala et al. Metformin suppresses triple-negative breast cancer stem cells by targeting KLF5 for degradation. Cell Discov 2017; 3:17010.
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