本期iProteome为大家带来了Jeroen 课题组近期发表在Cell上的 The Human RNA-Binding Proteome and Its Dynamics during Translational Arrest一文。
细胞中蛋白质和RNA以复杂的方式相互作用,参与多种生物过程。RNA大体可以分为三类:mRNA(信使RNA)、rRNA(核糖体RNA) tRNA(转运RNA)。各类RNA在遗传信息流中起着核心作用。但目前研究蛋白质-RNA相互作用的方法仅限于表征某种特定蛋白质的相互作用(如交联免疫沉淀测序[CLIP-seq]),特定种类的RNA(如RAP、CHIRP),因为这些方法依赖于RNA 多聚腺苷酸化,忽略了> 95%的非聚腺苷酸化的哺乳动物细胞RNA。这包括高丰度的“管家”RNA,如tRNA,rRNA,snRNA和snoRNA以及其他多种非编码RNA(ncRNA)。
本文开发了一种用于提取和纯化交联的蛋白质-RNA的方法——XRNAX,可以纯化各种RNA类型。并且,此方法XRNAX将蛋白质交联的RNA纯化为物理实体,可以作为各种下游应用的通用起点,比如测序和质谱(MS)。具体方法如下:
紫外交联细胞,用TRIZOL提取RNA时,收集TRIZOL中间层,洗涤去除游离蛋白和RNA,DNA酶消化以消除DNA,得到含有高浓度RNA(> 1,000 ng / mL)和蛋白质(> 0.7 mg的提取物)/ mL)的提取物。且实验结果表明DNA 含量<0.1% (weight DNA/weight RNA)。
接着,本文用蛋白酶K消化从MCF7细胞获得的XRNAX提取物,测序其RNA。为了比较,使用常规TRIZOL方案对从非交联的MCF7细胞中提取的总RNA进行测序。另外,在耗尽rRNA之前和之后对RNA进行测序以显示提取物的相对成分。结果表明XRNAX提取物含有在经典TRIZOL提取的RNA中也检测到的所有主要RNA类型。在几乎相同的测序深度下, XRNAX制备的中等丰度和低丰度转录物具有更好的覆盖率,检测到在XRNAX衍生的文库中观察到的6,306个转录物,包括1,500种蛋白质编码和1,500种大型基因间区非编码RNA(lincRNA)。
接下来使用MS分析XRNAX提取物的蛋白质组成,文章比较了XRNAX提取物与MCF7细胞的总裂解物的蛋白质组成。证实XRNAX提取物更多地富集RNA结合蛋白。为了证明是直接蛋白质-RNA相互作用而非特异性或间接蛋白质 - 蛋白质作用,本文在细胞培养中应用稳定同位素标记(SILAC)。首先,将重的SILAC MCF7细胞进行UV交联并与非交联的轻SILAC细胞组合,进行XRNAX并通过MS分析提取物的蛋白质含量。许多仅在重SILAC通道中显示强度的肽,表明RNA交联肽的富集。然而,文章注意到许多非富集的肽段来源于真正的RNA结合蛋白,这表明即使没有交联的蛋白也被困在 TRIZOL中间层。基于此,文章设计了一种基于变性二氧化硅的清理方法,二氧化硅柱在标准条件下保留了RNA而不是蛋白质交联的RNA,将XRNAX提取物进行了有限的胰蛋白酶消化,从而有效地保留了与蛋白质片段交联的RNA。二氧化硅富集后,RNA交联蛋白富集由69%变为89%。
本文将XRNAX与蛋白质组学相结合,应用于三个人源细胞系,MCF7,HeLa和HEK293,以得到人类RNA结合蛋白质组的整合网络图。RNA结合蛋白质组的表征证实了之前显示的大多数蛋白质与poly(A)RNA相互作用。除此之外,本文还鉴定了数百种非poly(A)相互作用物的蛋白质,其中许多蛋白质以前从未报道过与RNA相互作用。这包括一组溴结构域蛋白(据报道可结合eRNA),扩展了已知与ncRNA(例如PRC2,CoREST或SMCX)相互作用的染色质修饰复合物的集合,并强化了ncRNA可能发挥更广泛作用的观点。此外,文章发现poly(A)结合蛋白包含更多特定的低复杂度motif,通过液滴形成了自我聚集。特别是,许多带有IDR的poly(A)结合蛋白,如TIA,hnRNPA2或FUS,与mRNA成核有关(如应激颗粒(stress granules,SG))。
随后,文章用亚砷酸盐处理,探究蛋白质翻译受阻时的变化情况。亚砷酸盐诱导产生的翻译减少在10分钟后已经明显,30分钟后趋于平稳。对于大多数蛋白质,总的蛋白质表达水平没有改变,然而,一个明显的蛋白质群显示出丰度逐渐降低。GO分析表明,在亚砷酸盐处理5min后,下调的蛋白质与翻译相关。进一步研究发现,下调的为胞质核蛋白体,而非线粒体核蛋白体。Western blot结果确证亚砷酸盐处理后自噬增加。用自噬抑制剂spautin-1预处理后,亚砷酸盐处理产生的蛋白水平下调减轻。SILAC标记的MCF7经亚砷酸盐刺激,利用XRNAX、二氧化硅富集和MS分析,定量了765种蛋白质。尽管大多数蛋白质未变化,但有些蛋白质与RNA的结合显著降低,唯一增加超过2倍的蛋白质是TP53BP1。该数据集与总蛋白质组的数据比较结果显示,蛋白质TP53BP1和EXOSC2 与RNA结合的增加可以完全归因于它们与RNA的关系。RNA结合大量减少,相应蛋白丰度也降低。然而,与RNA结合的减少相比,这种程度的降低较小,表明主要源于RNA的释放。有趣的是,这一现象的发生与核糖体蛋白RPS28、RPS14和RPS3相关。几乎所有检测到的EIF蛋白丰度降低40%-50%,而RNA结合无显著变化。
最后,本文结合CLIP-seq来验证蛋白质组学数据。XRNAX 提取物经超声破碎后,用eCLIP免疫沉淀LMNB1。RNA测序鉴定了各种ncRNA,主要是snoRNA显著富集。另外本文发现成熟5.8S转录本的30段的富集非常显著,这是已知的5.8S rRNA成熟过程中外源体降解的主要区域。该结果表明EXOSC2在亚砷酸盐作用下被导入细胞核,以促进rRNA的成熟。
本文提出的XRNAX的方法,可以对不同种类的RNA交联蛋白进行纯化分析,并且文章使用大量实验对比证明此方法的可行性和可靠性。利用此方法鉴定了三种细胞系的人RNA结合蛋白质组,发现了700多个非poly(A)互作蛋白。并用亚砷酸盐刺激,鉴定到翻译受阻时蛋白的动态变化。
作者:张海珠
联系客服