本期iProteome为大家带来的是九月份发表在Nature Biotechnology上的“Blood metabolome predicts gut microbiome α-diversity in humans”一文。本文对399个健康人队列中约1000个血液分析物进行了分析，发现肠道微生物组α多样性45%的变异可由40种血浆代谢物解释。
摘要
肠道微生物组α-多样性的减少与一些人类疾病有关，但这在宿主分子表型中反映的程度却知之甚少。作者对399个健康人队列中约1000个血液分析物（实验室测试、蛋白质组学和代谢组学）分析发现肠道微生物组α多样性45%的变异可由40种血浆代谢物解释。并且这40种代谢物的预测能力在单独的验证队列（N=540）中得到证实。这里报道的几种代谢物生物标志物与心血管疾病，糖尿病和肾功能有关。在极度肥胖（体重指数≥35）的患者中，宿主代谢物与肠道微生物组α-多样性之间的关联发生改变，表明代谢紊乱。作者表明，也许能通过快速、廉价和可靠的血液检测来识别个体肠道微生物组α多样性，这将为开发监测肠道微生物健康的临床试验铺平道路。
导言
肠道微生物的组成或结构变化与各种人类疾病息息相关，包括糖尿病，结肠直肠癌和复杂的胃肠道功能紊乱等，例如炎性肠病（IBD）。虽然粪便代谢物可能更能反映微生物群的直接代谢输出，但血液代谢物提供了一个窗口，让我们了解哪些化合物进入了循环，从而可能影响宿主的新陈代谢和健康。代谢组学的出现，增加了我们对血液中代谢的理解，并使得肠道菌群产生流动的独特分子，这些分子是由肠道微生物群产生，并在宿主中发挥生物学作用。在监测肠道健康的背景下，反映肠道微生物群状态和可靠的临床血液测试可能对诊断，监测和治疗微生物组相关疾病具有重要意义。Shannon多样性总结了分类丰富度（即代表的物种数量）和均匀度（即频率与代表物种的相似程度），Shannon多样性是最常见的α多样性（即样本内多样性）指标，并作为微生物组健康的表征。据报道，在诊断患有IBD的个体中，相对于健康对照而言，Shannon多样性较低（例如由艰难梭菌或其他细菌病原体引起的肠道感染）。与此同时，据相关文献报道，超出α多样性的阈值也会产生有害的影响（比如，便秘与较高的shannon多样性有关）。因此，如何定义一个最佳肠道α多样性以及是否存在这种最佳的α多样性仍有待于进一步研究。
结果
为了研究宿主代谢组与肠道微生物组多样性之间的关系，作者将最小绝对收缩和选择算子方法（LASSO）应用于队列的基线血浆代谢组学数据，以生成香农多样性的样本外预测。在该队列中每个参与者测量的659种代谢物中，在最终模型中仅保留了40种代谢物（表1）。由LASSO保留的小部分血浆代谢物强烈预测shannon多样性，解释了平均45％的方差（图1a）。鉴定的代谢物主要属于异生素，脂质和氨基酸超家族，苯丙氨酸和酪氨酸代谢物的频率特别高（图1b）。在十倍交叉验证（CV）生成的十个模型中，至少有40种代谢物被保留，而所有十个模型中仅保留了11种代谢物，并且在预测香农多样性方面最具影响力（图1c）。脊回归在预测变量之间存在较高的共线性时，以及在预测变量中分布有大量小影响时，往往表现更好，在作者的分析中，LASSO模型的表现优于其中。具有十倍CV的岭回归仅解释了shannon多样性的平均35％的方差，这表明它确实是大部分独立的血浆代谢物的一小部分，其最强烈地反映了群组中的肠道微生物多样性。
作者进一步评估了40种已鉴定代谢物的能力，以预测肠道微生物α多样性的其他指标，包括PD whole tree和Chao1（图1d）。PD whole tree将系统发育差异纳入了多样性得分，而Chao1则是物种丰富度的衡量标准。使用十倍CV和仅有40种鉴定代谢物拟合的LASSO模型解释了PD whole tree多样性中平均50％的样本外变异，以及Chao1中36％的变异。重要的是，使用全血浆代谢组并未提高两个指标中任何一个的预测能力，证实所鉴定的代谢物的小子集足以捕获肠道微生物α-多样性中的大部分可解释的变异性。
筛选得到的代谢物用作肠道微生物多样性的生物标志物的可行性
使用LASSO生成的模型中，最强的Shannon多样性预测因子是人-微生物共代谢物，即最初由宿主合成然后随后被微生物组代谢的代谢物（例如，胆汁酸）。当来自LASSO的前11种代谢物与细菌属相关时，两种胆汁酸始终表现出相反的关联;Glyithocholate sulfate与最丰富的拟杆菌属Bacteroides反相关，而isoursodeoxycholate则表现出正相关性，对于几个Firmicutes属，情况正好相反（图2）。该杆菌属也与最强的阳性预测因子5α-雄甾-3β-17α-二醇二硫酸盐反相关，表明该分类单元优势的不断增强与我们队列中香农多样性的降低有关。
图2：11种最强代谢物预测因子与10种最丰富的微生物属的相关性
如前所述，在所有十种LASSO模型中，鉴定出的40种代谢产物中仅保留11种（图1c）。接下来，这些代谢物被用于使用随机森林算法的十倍CV实施来对具有低α多样性（下四分位数）的参与者进行分类。单独的11种代谢物能够基于Shannon多样性（平均灵敏度=0.72，平均特异性=0.90和平均精度=0.72）以及α多样性的其他度量（PD whole tree：平均敏感度=0.68，平均特异性=0.89，平均精度=0.67;Chao1：平均敏感度=0.64，平均特异性=0.88，平均精度=0.65）对参与者进行分类。这些结果加在一起表明11种已鉴定的代谢物有可能用作肠道微生物多样性的生物标记。
临床实验室测试显示不能预测α多样性
迄今为止，血液临床实验室测试仍然是用最常规分子指标来评估个体健康状况。然而，尚不清楚实验室测试是否或如何有效地捕获肠道微生物组的结构。为了评估这一点，作者使用与代谢组学相同的方法来预测来自多组临床分析物的shannon多样性。一组77个临床实验室测试无法准确预测个体Shannon多样性评分（平均LASSO R2 =0.01和平均岭回归R2 =0.05）。当线性回归用于独立评估每个临床实验室和香农多样性的关系时，进一步证实了临床实验室结果与香农多样性的弱关联。在77个临床实验室测试中，28个与shannon多样性显著相关（FDR<0.05;图3b）。然而，没有临床分析物能够解释shannon多样性的变异超过6％，代谢健康标志物（脂蛋白胰岛素抵抗，甘油三酯和胰岛素）评分在所有分析物中排名最高（图3b）。相比之下，BMI单独解释了Shannon多样性7.5％的方差，高于任何单一的临床分析物这就表明临床实验室测试并不能预测α多样性。
图3：临床实验室测试中的shannon多样性和宿主代谢组
血液蛋白与shannon多样性有关
除临床实验室结果和代谢组学外，作者接下来还对399名参与者中的262名进行了蛋白质组的测定，共测量了263种独特的血浆蛋白。使用线性回归并针对多重假设检验进行调整，作者从263种中确定了41种蛋白质与shannon多样性显着相关（FDR <0.05）。与临床实验室结果相似（图3b），与代谢最密切相关的分析物是对氧磷酶 3，瘦素和低密度脂蛋白（LDL）受体。最后，使用与代谢组学相同的惩罚回归方法来评估测量的血浆蛋白反映shannon多样性的强度。血浆蛋白质组比临床实验室结果更能预测shannon多样性，解释了平均13％的方差。然而，该预测能力仍然明显弱于血浆代谢组的预测能力。
肥胖症患者人群代谢组-微生物组关系---对极度肥胖人群无效
肥胖一直与代谢紊乱以及血液代谢组的实质性变化有关。此外，一些研究报告称肥胖者与正常体重者的shannon多样性相比有所降低。为了进一步探讨shannon多样性，肥胖与血浆代谢组三者之间的关系，作者根据BMI将队列分为四组（表2）。由于与肥胖相关的风险因BMI增加程度而发生改变，因此肥胖通常分为三类（I类=30-34.9kgm-2，II类=35-39.9kgm-2，III类≥40kgm-2）。对于这项分析，作者结合了II级和III级肥胖（严重肥胖），但分别考虑了I类（“低风险” ）肥胖。随着BMI的增加，肠道α-多样性的所有三个指标均显著降低，在所有组中，肥胖II/III类的参与者表现出最低的多样性得分（表2）。特别是，对于Chao1和PD WHOLE TREE多样性，肥胖II/III组的参与者得分显著低于所有其他BMI类别，包括I型肥胖。肥胖II/III组的参与者也表现出更大的β分散，提示肥胖II / III组参与者的肠道微生物组比低BMI组参与者的肠道菌群变化更大。在BMI类中，健康分子标志物逐渐恶化，但肥胖标志物如白细胞介素-6（IL-6）和C反应蛋白在肥胖II/III组中特别升高（表2和图4a）。
表2 总基线发现群组队列特征并按BMI分类
图4：严重肥胖症中的肠道微生物组-宿主代谢组
为了评估不同BMI类人群血浆代谢组中Shannon多样性的反映是否存在变异性，对在所有10种LASSO模型中保留的Shannon多样性与五个最强代谢物预测因子（平均β系数的最大绝对值）之间的关系进行了评估。每个BMI类别均进行了年龄和性别调整（图4b）。尽管大多数代谢物的所有BMI类的β系数都相似，但5α-雄甾烷3β-17α-二醇二硫酸盐与肥胖II / III组的Shannon多样性无显着相关性，而其他所有参与者之间均具有显着的正相关性（图4c，d），这表明通过Shannon多样性来预测肠道微生物组α-多样性对极度肥胖人群是无效的。
验证队列中的代谢组-微生物组关系
为了证实作者的发现，作者在另外540人的验证队列中进行了验证。使用在发现队列中确定的40种代谢物的LASSO模型来预测验证队列中的Shannon多样性。40种代谢物LASSO模型的样本外预测准确度较低，但与发现队列相似（平均R2 =0.34，Pearsonr =0.60;图5a）。此外，使用十倍CV将发现队列中所有LASSO模型中保留的11种代谢物的β系数与验证队列中拟合的平均β系数进行了比较，显示了模型之间的强相关性（Pearson's r = 0.94，P = 2.05×10-5；图5b）。仅40种代谢物就能够解释验证组中血液代谢物组捕获的shannon多样性的大部分差异。使用整个代谢组（659个代谢物）生成一个单独的LASSO模型，仅略微提高了模型的预测能力（平均R2 = 0.38；图5c）。在验证队列中作者还研究了临床实验室测试和蛋白质组学的预测能力，与作者的最初研究结果一致，临床实验室测试证明与shannon多样性几乎没有对应关系（图5c）。验证集中540名参与者中只有176人拥有可用的蛋白质组学数据，在这个验证队列的亚组中，作者无法确定血液蛋白质组预测shannon多样性的中等能力，因为解释的平均方差低于临床实验室结果（图5c）。最后，作者使用发现队列中鉴定的11个最强Shannon多样性预测因子对具有低Shannon多样性（下四分位数）的参与者进行分类，在验证集中进行了研究，得到了类似的结果（灵敏度=0.65，特异性=0.87，精度=0.64）。（图5d，e）。相比之下，临床实验室结果表明，在对相同参与者进行分类时表现较差（敏感度=0.51，特异性=0.72，精确度=0.37），与发现队列的结果一致。总的来说，这些研究结果表明了40个代谢物，特别是11个核心代谢物和肠道微生物组多样性之间的相关性。
图5：验证群组中的肠道微生物组-宿主代谢组关系
作者接下来探讨了发现队列中肥胖类别中宿主代谢组-肠道微生物组关系的主要差异。然而，验证组中肥胖II/III组的参与者数量显著低于发现组（n =34），这限制了作者的统计学效力。为了提高统计学效力，将肥胖II/III组的参与者从发现和验证队列汇集在一起（n =90），并使用线性评估5α-雄甾-3β-17α-二醇二硫酸盐与shannon多样性之间的关系。即使统计学效力增加，5α-雄甾-3β-17α-二醇二硫酸盐与shannon多样性之间也没有显著关联，表明该代谢产物与严重肥胖症下的shannon多样性之间缺乏关联，这为发现队列中的研究结果提供了进一步的证据。
结论
尽管在过去十年中已发现肠道微生物组与疾病之间存在很大的关联，但我们仍然不了解什么构成了“健康”的微生物组-宿主关系。微生物组的群落结构与人类健康之间的联系很可能取决于环境的复杂程度，具体取决于饮食行为，接触病原体和抗生素的情况，遗传学和其他因素。作者的工作整合了来自大量个体人群的多组学数据，为阐明“健康”微生物组-宿主相互作用的特性提供了前进的方向。
本研究的目的是检查肠道微生物组α-多样性与血液中测量的大量分析物之间的关系。作者从参与健康计划的数百名个体的队列中生成并分析了基线数据，包括在21天内进行的大量血液测量（代谢组，蛋白质组和临床实验室测试）和粪便微生物组。这项研究的主要发现是：（1）40种血浆代谢物可用于预测一群主要健康的美国成年人的肠道微生物组Shannon多样性，但广泛的临床实验室检测组和一组263种蛋白质并不能做出相同的预测;（2）作者研究中与shannon多样性相关的特定代谢物也与人类健康有关，如微生物代谢产物三甲胺N-氧化物（TMAO），丙酸咪唑和对甲酚硫酸盐;（3）shannon多样性预测准确反映了与肠道健康相关的肠道微生物多样性的变化，表明肠道微生物组织结构与宿主生理学之间存在密切联系;（4）在整个BMI谱中，特定代谢物和shannon多样性之间存在可变的关系，特别是严重（II / III类）肥胖患者的这种关系受到破坏。总的来说，作者的结果能够让我们更好的了解宿主生理学与肠道微生物组之间关系，并将宿主代谢组的特征作为探索肠道生态系统与人类健康之间的重要窗口。
作者：冉鹏
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