蟾酥软膏对类风湿性关节炎抗炎镇痛作用及机理研究

1目的 类风湿性关节炎(RA)是以关节病变为主并伴有多系统受累的慢性炎症性疾病，发病率仍呈上升趋势，市场上对治疗类风湿性关节炎的有效药物需求极大。目前西医抗RA常用一、二线药物和糖皮质激素，但这些药物大多毒副作用和不良反应较大，依赖性强。为此寻找一种安全、有效、可控，用于治疗类风湿性关节炎和改善症状的中药新制剂具有积极意义。 采用蟾酥制成软膏剂，选用透皮给药方法可避免肝脏首过效应和胃肠道破坏，不受胃肠道酶、消化液、pH值等诸多因素的影响，可提高生物利用度，达到既可延长药物作用时间，又可降低药物毒性和副作用，维持稳定而持久的血药浓度的目的，为RA患者提供一个更有效的治疗方法。 本课题研究目的是探索蟾酥软膏对类风湿性关节炎抗炎镇痛的药效作用，并考察对关节的病理影响，为治疗RA提供一个更有效的方法，并扩大蟾酥的用药途径。 2方法 本课题实验研究分为三个部分： 2．1蟾酥软膏的镇痛作用研究 2．1．1热板法 取SPF级18～22g痛阈5～30sNIH小鼠，雌性，随机分5组，即空白对照组、阳性对照组(法斯通凝胶)、3％、6％、12％蟾酥软膏组，各组小鼠腹部剃毛，空白组外涂卡波姆基质0.1g／只，阳性对照组外涂法斯通0.1g／只，其余给药组外涂各浓度蟾酥软膏0.1g／只，每天涂药1次，连续7天，末次涂药后30，60，90min各把小鼠放在预热至50℃的智能热板仪上，以小鼠舔后足反应的潜伏期为痛阈指标，比较各组差异。 2．1．2扭体法 取SPF级18～22gNIH小鼠，雌雄各半，随机分为空白对照组、阳性对照组、3％蟾酥软膏组、6％蟾酥软膏组和12％蟾酥软膏组，腹部剃毛后分别外涂该组药物0.1g／只／天，连续7天，末次涂药后1h腹腔注射0.6％醋酸生理盐水0.01ml／g体重，观察并记录30min内小鼠出现的扭体次数，比较各组差异。 2．2蟾酥软膏的抗炎作用研究 2．2．1蟾酥软膏对蛋清所致大鼠足肿胀的影响 SPF级体重180～220g SD大鼠，雌雄各半，随机分为空白对照组、阳性对照组、3％、6％和12％蟾酥软膏组。先用足趾容积测量仪测量大鼠后肢足趾容积，然后分别足趾部外涂该组药物1g／只／天，连续7天，末次涂药后1h每鼠右后足跖皮下注射新鲜蛋清0.2ml，分别于1、2、3、4h测量大鼠后肢足趾容积各一次，计算足趾肿胀程度，比较各组差异。 2．2．2蟾酥软膏对小鼠腹腔毛细血管通透性的影响 SPF级体重18～22gNIH小鼠，雌雄各半，随机分为空白对照组、阳性对照组、3％、6％和12％蟾酥软膏组，腹部剃毛分别外涂该组药物0.1g／只／天，连续7天，末次涂药后1h每只小鼠均尾静脉注射0.5％伊文思蓝0.01ml／g体重，随即腹腔注射0.6％醋酸生理盐水0.2ml／只，20min后脱颈椎处死，剖开腹腔，用5ml生理盐水洗涤数次，收集洗液并调整终体积至8ml，离心，取上清液于分光光度计590nm测吸光度，比较各组差异。 2．2．3蟾酥软膏对大鼠棉球肉芽肿的影响 SPF级体重180～220g SD大鼠，雌雄各半，随机分为空白对照组、阳性对照组、3％、6％和12％蟾酥软膏组。大鼠乙醚浅麻醉，腹部用碘酒消毒，75％酒精棉球脱碘，切1cm长小口，取两个20±1mg高压灭菌棉球分别植入大鼠两侧腋窝皮下，随即缝合皮肤。手术当日始分别外涂该组药物0.1g／只／天，连续7天，末次给药后脱颈椎处死，取出棉球，剔除脂肪组织，放烘箱60℃烘干，称重，减去原棉球重量即得肉芽肿净重。 2．2．4蟾酥软膏对佐剂性关节炎大鼠模型的影响 SPF级体重180～220g SD大鼠，雌雄各半，随机分为空白对照组、模型组、阳性对照组、3％、6％和12％蟾酥软膏组。模型组、阳性对照组、3％、6％和12％蟾酥软膏组每鼠右后足跖皮下注射弗氏完全佐剂0.1ml，空白对照组大鼠右后足跖皮下注射生理盐水0.1ml，然后分别外涂该组药物1g／只／天，连续7天。 观察指标： a．足趾肿胀程度的测量：造模前先用足趾容积测量仪测量大鼠后肢足趾容积，此后隔周测量大鼠右后肢足趾容积各一次，计算足趾肿胀程度，比较各组差异。 b．足跖组织液IL-1β、TNF-α、PGE_2的含量测定：末次涂药后1h，剥离足跖关节皮毛、肌肉，取足跖关节剥除趾骨后将组织匀浆，测定大鼠足跖组织液IL-1β、TNF-α、PGE_2的含量。 c．血清SOD活力的检测：末次涂药后1h，每只动物从心脏抽血1ml离心取血清按SOD测试盒方法检测大鼠血清SOD活力。 d．血沉的测定：末次涂药后1h，每只动物从心脏抽血1.6ml加入0.4ml枸橼酸钠抗凝剂，吸入血沉管至“0”刻度处，将血沉管直立在血沉架上记时，在室温22℃下静置1h，观察记录红细胞下沉mm数。 e．足跖关节病理观察：末次涂药后1h将大鼠放清体血，剥离足趾关节皮毛、肌肉、肌腱组织并暴露关节，取足趾关节剥除滑膜后以中性福尔马林固定。EDTA液脱钙2周后石蜡包埋，切片HE染色检测，观察软骨缺损范围深度、纤维组织增生、软骨炎细胞浸润等。 2．3皮肤毒理学实验研究 2．3．1皮肤急性毒性试验研究 普通级新西兰兔，雌雄各半，体重2.0kg左右，随机分成对照组(卡波姆基质)和试验组(21.6％蟾酥软膏，为最大可溶浓度)：完整皮肤组和破损皮肤组。取每种受试药物3g分别均匀涂于脱毛区，并用无刺激性纱布及绷带加以固定。给予受试药物24小时，去除受试物后1，24，48，72小时至第七日，每日观察并记录动物的体重、皮肤毛发、眼和粘膜的变化、呼吸、中枢神经系统、四肢活动等及其他中毒表现。 2．3．2皮肤刺激性试验研究 动物：普通级新西兰兔，雌雄各半，体重2.0kg左右。 a．完整皮肤的局部刺激性试验：试验采用同体左右侧自身对比，左侧去毛区涂受试药21.6％蟾酥软膏1g，右侧去毛区涂卡波姆基质1g，并用无刺激性纱布及绷带加以固定。其中单次给药刺激性试验在涂药24h后，用温水洗去残留药物，去除受试药物后1 h，24 h，48h，72h肉眼观察皮肤反应；多次给药刺激性试验连续给药7天，再停药7天。除观察、记录每日的红斑及水肿情况还应观察涂药部位是否有色素沉着、出血点、皮肤粗糙或者皮肤菲薄等情况。 b．破损皮肤的局部刺激性试验：试验前24h，用脱毛剂将兔背部脊柱两侧脱毛后再用细砂纸摩擦造成局部擦伤，以局部渗血为度，左右两侧皮肤的破损程度应基本一致。其余步骤同完整皮肤局部刺激性试验。 2．3．3皮肤致敏试验研究 普通级白化豚鼠，雌雄各半，体重200g～250g，随机均分为空白对照组(卡波姆基质)、阳性对照组(1％2，4-二硝基氯代苯)和试验组(21.6％蟾酥软膏)共3组，雌雄各半。致敏接触：于左侧褪毛区，空白对照组涂卡波姆基质0.2g，阳性对照组涂1％的DNCB 0.2ml，试验组涂21.6％蟾酥软膏0.2g。所有动物涂药后，用无菌纱布覆盖，无刺激胶布封闭、固定，动物分笼饲养，维持6h，于涂药后第7天和第14天，以同样的方法重复涂药一次。激发接触：于末次给药后第14天，先用温水洗净右侧褪毛区，空白对照组涂卡波姆基质0.2g，阳性对照组涂0.1％的DNCB 0.2ml，试验组涂21.6％蟾酥软膏0.2g。分别于给药6h、24h、48h、72h观察皮肤过敏反应情况，记录各时间点所有动物的过敏反应分值，同时注意观察动物是否有哮喘、站立不稳或休克等严重的全身性过敏反应。 3结果 3．1蟾酥软膏的镇痛作用研究 3．1．1热板法：阳性对照组和3％蟾酥软膏组小鼠痛反应潜伏期均明显高于空白组(P＜0.05)，6％蟾酥软膏组小鼠痛反应潜伏期显著高于空白组(P＜0.01)，也显著高于阳性对照组(P＜0.01)，12％蟾酥软膏组小鼠痛反应潜伏期显著高于空白组(P＜0.01)，3％和12％蟾酥软膏组与阳性对照组比较无显著性差异(P＞0.05)。 3．1．2扭体法：阳性对照组小鼠扭体次数与空白组比较明显较少(P＜0.05)，3％、6％和12％蟾酥软膏组小鼠扭体次数均显著低于空白组(P＜0.01)。 3．2蟾酥软膏的抗炎作用研究 3．2．1蟾酥软膏对蛋清所致大鼠足肿胀的影响：6％蟾酥软膏组大鼠右足趾肿胀度显著低于空白组(P＜0.01)，阳性对照组、3％和12％蟾酥软膏组右足趾肿胀度均显著低于空白组(P＜0.05)。 3．2．2蟾酥软膏对小鼠腹腔毛细血管通透性的影响：3％、6％、12％蟾酥软膏组小鼠腹腔洗液OD值显著低于空白组(P＜0.01)，阳性对照组小鼠腹腔洗液OD值与空白组比较无显著性差异(P＞0.05)。 3．2．3蟾酥软膏对大鼠棉球肉芽肿的影响：阳性对照组、3％蟾酥软膏组、6％蟾酥软膏组和12％蟾酥软膏组大鼠肉芽肿重量显著低于空白组(P＜0.01)。 3．2．4蟾酥软膏对佐剂性关节炎大鼠模型的影响 a．足趾肿胀程度的测量：阳性对照组、3％蟾酥软膏组、6％蟾酥软膏组和12％蟾酥软膏组大鼠右足趾肿胀度均显著低于模型组(P＜0.01)。 b．足跖组织液IL-1β、TNF-α、PGE_2的含量测定：空白组大鼠足跖组织液IL-1β含量显著低于模型组(P＜0.01)，3％、6％和12％蟾酥软膏组大鼠足跖组织液IL-1β含量均显著低于模型组(P＜0.05)，阳性对照组大鼠足跖组织液IL-1β含量与模型组比较无显著性差异(P＞0.05)；空白组、阳性对照组、3％、6％和12％蟾酥软膏组大鼠足跖组织液TNF-α含量均显著低于模型组(P＜0.01)；空白组大鼠足跖组织液POE_2含量显著低于模型组(P＜0.01)，阳性对照组、3％、6％和12％蟾酥软膏组大鼠足跖组织液PGE_2含量均显著低于模型组(P＜0.05)。 c．血清SOD活力的检测：空白组和3％蟾酥软膏组大鼠血清SOD活力均显著高于模型组(P＜0.05)，6％和12％蟾酥软膏组大鼠血清SOD活力均显著高于模型组(P＜0.01)，阳性对照组大鼠血清SOD活力与模型组比较无显著性差异(P＞0.05)。 d．血沉的测定：空白对照组大鼠血沉速度显著低于模型组(P＜0.01)，阳性对照组、3％蟾酥软膏组、6％蟾酥软膏组和12％蟾酥软膏组血沉速度均显著低于模型组(P＜0.05)。 e．足跖关节病理观察：空白组：软骨关节面平滑无缺损，软骨细胞分布均匀有序；模型组：软骨关节面遭破坏严重，达软骨下骨组织，纤维组织增生；阳性对照组：软骨关节小缺损，炎症细胞轻度浸润；3％蟾酥软膏组：软骨关节面缺损较重，纤维组织增生及炎症细胞浸润明显；6％蟾酥软膏组：软骨关节面小缺损，较少炎症细胞浸润；12％蟾酥软膏组：软骨关节面小缺损，纤维组织增生及炎症细胞浸润较轻。 3．3皮肤毒理学实验研究 3．3．1皮肤急性毒性试验研究：给药后的7天里，各受试动物体重无减轻，皮肤完整、无红肿，未脱毛区无脱毛现象，眼睛粘膜无变化，呼吸、神智、活动正常，未出现其他中毒表现，无1例动物死亡。 3．3．2皮肤刺激性试验研究： a．完整皮肤：单次给药24h后，21.6％蟾酥软膏皮肤刺激性总评分为零，为无刺激性。动物活动、食欲、排便均正常。各时段内局部皮肤颜色正常，未发现刺激性反应。连续涂药7日后，皮肤刺激性评分均为零，为无刺激性。动物活动、饮食、粪便等情况均正常，眼、鼻等亦无异常分泌物出现等。涂药部位未发现色素沉着，未见出血点。 b．破损皮肤：单次给药24h后，21.6％蟾酥软膏皮肤刺激性总评分为零，为无刺激性，动物均无异常反应。动物活动、食欲、排便均正常。各时段内局部皮肤颜色正常，未见刺激性反应。连续涂药7日后，皮肤刺激性平均评分为0.0536，无刺激性。动物活动、饮食、粪便等情况均正常，眼、鼻等亦无异常分泌物出现等。涂药部位未发现色素沉着，未见出血点。 3．3．3皮肤致敏试验研究：21.6％蟾酥软膏对豚鼠致敏反应记分均为0，依据致敏发生率计算公式可计算得致敏发生率为0，判定蟾酥软膏皮肤致敏性评价为无致敏性；试验中未发现动物有哮喘、站立不稳或者休克等全身性过敏性反应。 4结论 通过热板法和扭体法实验，说明了三个浓度蟾酥软膏均一定的镇痛作用，尤以6％蟾酥软膏作用最明显。 采用蛋清致大鼠足趾肿胀，蟾酥软膏各浓度组均能减轻足趾肿胀程度，对一般性炎症有一定抗炎作用。小鼠腹腔注射醋酸能使毛细血管通透性增加，蟾酥软膏可抑制这种作用，缓解毛细血管液体渗出。蟾酥软膏对大鼠棉球植入引起的肉芽肿增生有明显的抑制作用。 采用弗氏完全佐剂大鼠足趾部注射造成大鼠佐剂性关节炎，蟾酥软膏各浓度组均能减轻足趾肿胀程度，有一定抗炎作用。蟾酥软膏可以有效减少佐剂性关节炎关节组织液IL-1β、TNF-α和PGE_2的含量，从而抑制它们的致炎作用，减缓炎症渗出及软骨破坏。蟾酥软膏能增强SOD活力，使自由基歧化而清除，减缓炎症损伤。90％类风湿性关节炎病人血沉加快，可能由于炎症分子引起的纤维蛋白原的激活而使血红细胞沉降速度加快，蟾酥软膏能减缓血沉速度的加快。足跖关节病理切片光镜下观察，与模型组比较，阳性对照组和6％、12％蟾酥软膏组大鼠足跖软骨关节破坏较轻，炎性浸润和纤维组织增生不及模型组严重，说明蟾酥软膏能防止大鼠佐剂性关节炎关节受炎症破坏受损。 蟾酥软膏最大可溶浓度(21.6％)，试验过程中未出现受试动物中毒表现，并无引起受试动物出现皮肤刺激性及过敏现象，说明蟾酥软膏在局部皮肤用药上是基本安全的。 通过上述实验结果，蟾酥软膏可能就是通过调节免疫细胞因子、炎症介质的产生，而达到抗炎镇痛效果并阻止关节软骨及骨组织受破坏。