基于网络药理学探讨鹿角霜对乳腺癌干细胞活性及TGF

目的:采用网络药理学联合人乳腺癌细胞(MDA-MB-231)体外模型,探讨鹿角霜能否通过干预TGF-β信号通路抑制肿瘤干细胞样特性发挥抗肿瘤作用,为补肾类中药鹿角霜在乳腺癌预防及治疗的临床应用提供理论依据。方法:1.采用中医药数据库BATMAN-TCM和中国知网收集鹿角霜的化学成分信息,利用BATMAN-TCM和TCMSP数据库预测各化学成分的潜在靶点,用Gene Cards数据库获取乳腺癌干细胞靶点,二者取交集获得鹿角霜干预乳腺癌干细胞潜在靶点,用String数据库对潜在靶点进行蛋白互作分析,获得鹿角霜干预乳腺癌干细胞关键靶点和化合物,利用Metascape数据库进行GO和KEGG通路注释分析,利用Cytoscape3.8.0软件对鹿角霜干预乳腺癌干细胞的药物-成分-靶点-通路构建网络图,并进行分析。2.将细胞分为四组,空白对照组、0.2mg·m L~(-1)鹿角霜含药血清处理组、0.4mg·m L~(-1)鹿角霜含药血清处理组和0.6mg·m L~(-1)鹿角霜含药血清处理组。培养24h后显微镜下观察细胞形态并记录;采用CCK-8细胞增殖实验检测鹿角霜含药血清对乳腺癌细胞MDA-MB-231増殖程度的影响;采用软琼脂集落形成实验检测鹿角霜含药血清对乳腺癌细胞MDA-MB-231集落形成能力的影响;采用实时荧光定量方法检测鹿角霜含药血清作用于乳腺癌细胞MDA-MB-231后TGF-β信号通路中TGFBR1和SMAD2的m RNA转录水平;采用Western Blot方法检测鹿角霜含药血清作用于乳腺癌细胞MDA-MB-231后TGF-β信号通路中TGFBR1和SMAD2的蛋白表达水平。结果:1.从BATMAN-TCM数据库和知网获得鹿角霜成分33个,从BATMAN-TCM和TCMSP数据库获得鹿角霜潜在靶点16377个,从Gene Cards数据库获得乳腺癌干细胞靶点688个,将鹿角霜和乳腺癌靶点取交集后获得共有靶点503个,用String数据库对503个共有靶点进行蛋白互作分析,筛选得到20个核心靶点IL6、VEGFA、GAPDH、STAT3、INS、TNF、CXCL8、AKT1、MAPK3、MYC、MAPK1、TP53、FN1、CASP3、MMP9、JUN、CXCR4、EGF、SRC、NOTCH1及其相对应的6个关键化合物磷酸钙、碳酸钙、丙氨酸、天冬氨酸、丝氨酸、苏氨酸,利用Metascape数据库对503个共有靶点进行基因功能分析,得到生物学过程3938条,主要参与了调节细胞粘附、调节蛋白激酶活性、淋巴细胞活化、转移酶活性的正调控、血管发育、细胞群增殖的负调控、激酶活性的正调控、血管发育、MAPK级联的调节、白细胞分化等;细胞组分208条,主要参与了膜的侧面、受体复合物、细胞质核周区、膜筏、膜微区、质膜蛋白复合物、质膜外侧、粘着、细胞-基底连接、转移酶复合物等;分子功能326条,主要是激酶结合、转录因子结合、激酶活性、蛋白质结构域特异性结合、蛋白激酶结合、磷酸转移酶活性,醇基为受体、蛋白激酶活性、受体调节活性、受体配体活性、信号受体激活剂活性等。京都基因本体论分析170条,主要是癌症的途径、PI3K-Akt信号通路、Ras信号通路、Rap1信号通路、乳腺癌、细胞因子-细胞因子受体相互作用、MAPK信号通路、TGF-β信号通路、Wnt信号通路、刺猬信号通路、Notch信号通路等。通过鹿角霜干预乳腺癌干细胞的药物-成分-靶点-通路网络图说明鹿角霜可以通过“多成分-多靶点-多通路”来干预乳腺癌干细胞。2.鹿角霜含药血清对乳腺癌细胞MDA-MB-231形态的影响与空白对照组相比,鹿角霜含药血清组的MDA-MB-231细胞数量明显减少,存活能力下降,细胞稀落,形态不规则,体积明显缩小,部分细胞脱落,悬于培养液之中。3.鹿角霜含药血清对乳腺癌细胞MDA-MB-231増殖的影响CCK-8细胞增殖实验结果显示,与空白对照组相比,0.2mg·m L~(-1)、0.4mg·m L~(-1)、0.6mg·m L~(-1)三种不同浓度鹿角霜含药血清均可以抑制乳腺癌细胞增殖(P<0.05),而浓度为0.6mg·m L~(-1)的鹿角霜含药血清对MDA-MB-231细胞增殖的抑制作用最显著;软琼脂集落形成实验结果显示,三种不同浓度鹿角霜含药血清均可以抑制乳腺癌细胞集落形成数(P<0.05),而0.6mg·m L~(-1)的鹿角霜含药血清对细胞集落形成数的抑制作用最显著。4.鹿角霜含药血清对TGF-β信号通路中TGFBR1、Smad2表达量的影响实时荧光定量实验结果显示,与空白对照组相比,0.2mg·m L~(-1)、0.4mg·m L~(-1)、0.6mg·m L~(-1)三种不同浓度鹿角霜含药血清干预24h后的乳腺癌MDA-MB-231细胞中TGFBR1、Smad2 m RNA转录水平显著降低(P<0.01);Western Blot实验结果显示,与空白对照组相比,0.2mg·m L~(-1)、0.4mg·m L~(-1)、0.6mg·m L~(-1)三种不同浓度鹿角霜含药血清干预24h后的乳腺癌MDA-MB-231细胞中TGFBR1、Smad2蛋白表达水平显著降低(P<0.01)。结论:本研究从网络药理学和体外细胞模型中发现,鹿角霜不同浓度含药血清中的多个组分,能够协同作用于乳腺癌干细胞的目标差异表达基因,并通过下调TGF-β通路中关键分子TGFBR1及下游信号Smad2蛋白的表达水平,抑制乳腺癌细胞增殖,发挥抗乳腺癌作用。