中国云南省HIV/AIDS患者基因变异与耐药的研究

研究目的:艾滋病(Acquired Immune Deficiency Syndrome,AIDS)即获得性免疫缺陷综合征是一种由人类免疫缺陷病毒1型(human immunodeficiency virus type 1,HIV-1)感染引起的严重威胁人类生命健康的重大传染病。HIV-1属反转录RNA病毒科(Retroviridae)灵长类慢病毒属(Lentivirus)。Pol基因是HIV-1的三个结构蛋白基因之一,在病毒感染过程中该蛋白与易感细胞表面受体结合,介导病毒对细胞的感染。至今艾滋病仍为难治之症。高效抗逆转录病毒治疗(highly active antiretroviral therapy,HAART)是目前唯一能持续有效抑制HIV复制、重建机体免疫功能和缓解临床症状及延长患者生命的治疗方法。但不能清除HIV病毒,未接受和接受治疗的AIDS患者都可以产生耐药性和细胞间传播病毒。因此,研究有效抗HIV策略具有重要意义。在本项工作中,我们首先研究2014年中国云南省HIV/AIDS疫情较严重的红河和临沧两个地区的HIV基因变异与原发性耐药情况,同时研究2013年中国云南省HAART治疗失败患者中基因变异与继发性耐药情况。研究发现将有助于监测HIV/AIDS流行、诠释HIV基因进化、干预传播、从而优化抗病毒治疗方案和和设计疫苗。研究方法:采用In-house方法,首先对2014年中国云南省红河与临沧地区未接受HAART治疗的HIV/AIDS患者254例及2013年中国云南省接受HAART治疗失败患者1354例的HIV-1结构蛋白pol基因进行扩增、测序,将所得序列用ContigExpress、BioEdit及HIV BLAST软件进行拼接、校对、基因分型。运用Los Alamos HIV Database在线工具RIP和jphMM进行初步分析,以Simplot软件定位重组位点,接着将序列提交至Stanford HIV Drug Resistance Database,对耐药位点进行分析。基于中国云南省HIV-1主要亚型分布,运用MEGA6.0软件构建B/C亚型的Neighor-joining系统进化树,并与不同地区的B、C亚型参考株进行比对,估计其亲缘性关系。研究结果:1.发现2014年中国云南省红河与临沧地区原发耐药发生率达到11.8%,其中临沧地区耐药发生率为11.4%,红河地区耐药发生率为12.0%。rpv的耐药发生频率达到9.1%,发现主要突变位点分别为e138a、v179d、t69ins。发现2013年中国云南省总耐药发生率为1.5%,云南省1354例接受haart治疗失败患者中,耐药发生率高达46.2%。其中nrtis、nnrtis和pis三类药物中任意一种出现耐药频率为21.8%,任意两种药物发生耐药的比率是23.6%,同时对三类药物均发生耐药比率0.8%(11例)。通过对中国云南省16个州市的继发性耐药情况分析,还发现德宏地区继发性耐药发生率严重,昆明、红河、文山地区耐药发生率较严重。在nrtis中,3tc和ftc发生耐药的频率较高,均为23.9%;常见的突变位点是m184v/i(23.0%)。在nnrtis中,efv与nvp的耐药发生率最高,达到41.7%,其次是etr耐药发生率为19.7%;容易产生耐药突变位点居前三的位点分别是k103n/s(21.1%)、g190a/s/e(11.4%)和y181c/i/v(10.0%)。在pis中,最容易出现耐药的是nfv(2.1%);常见突变位点分别是l33f(0.6%)、m46i(0.4%)、i54v(0.3%)。tdf和lpv/r先后作为二线药物被纳入抗病毒治疗方案中,也出现不同程度的耐药,分别占7.5%和0.4%。2.发现接受haart治疗失败患者中crf01_ae、crf07/08_bc亚型pol基因rt区的突变位点,其中主要耐药位点a62、t69、v179和e138位突变频率在三种亚型之间有显著性差异。还发现包括v35、t39、k43、s48、v60、k122、i135等在内的27个新型突变位点。3.发现中国云南省2013年997例首次出现病毒学应答失败的是在抗病毒治疗时间大于18个月,其耐药发生的比率超过50%;发现hiv-1最早对nnrtis中的efv和nvp产生耐受性,发生耐药的平均时间约为33个月,其中对efv主要表现为中高度耐药性,对nvp主要表现为高度耐药性。其次是nrtis中的abc、3tc和ftc,发生耐药的平均时间约为47个月,其中对abc的耐药主要为低水平耐药性,对3tc和ftc的耐药为高水平耐药性。4.发现在中国云南省红河州2010年至2013年haart失败患者中,耐药发生情况总体上与云南省耐药情况接近。在nrtis中,发生ddi耐药的比例较高达到21.0%;除了m184v/i外,a62v在该地区具有明显的突变,突变频率高达12.6%;在nnrtis中,除k103n/s、g190a/s/e和y181c/i/v外,该地区hiv/aids患者中发生v179d/e/f突变的比例较高。5.发现中国云南省主要的流行毒株是crf08_bc、crf07_bc以及crf01_ae。在重组毒株中,b’与c重组最为常见,其次是发现crf01_ae与b’、c亚型或b’/c重组。基于中国云南省hiv-1主要亚型分布,发现在10条b亚型序列中,其中有5条序列与贵州地区的B亚型亲缘性关系更近,而与云南分离株亲缘性关系较近的仅有2条;在22条C亚型序列中,其中有13条序列与云南和印度分离株亲缘性关系较远,5条序列与印度C亚型亲缘性较近,4条与云南C亚型亲缘关系较近较高。结论:1.发现中国云南省红河与临沧地区原发性耐药发生率高,特别是红河地区原发性耐药发生率高达12.0%。发现中国云南省接受HAART治疗失败患者中,继发性耐药发生率高达46.2%。在NRTIs中,3TC和FTC发生耐药的频率较高,常见的突变位点是M184V/I。在NNRTIs中,EFV与NVP发生耐药的频率最高,其次是ETR。耐药突变位居前三的位点分别是K103N/S、G190A/S/E和Y181C/I/V。在PIs中,NFV最容易发生耐药;常见突变位点分别是L33F、M46I、I54V。2.发现接受治疗失败患者中CRF01_AE、CRF07/08_BC亚型pol基因RT区的突变位点,其中主要位点A62、T69、V179和E138位突变频率在三种亚型之间有显著性差异。还发现27个新型突变位点。3.发现中国云南省AIDS患者最早对NNRTIs中的EFV和NVP产生耐受性,发生耐药的平均时间约为33个月,其中对EFV主要表现为中高度耐药性,对NVP主要表现为高度耐药性。其次是NRTIs中的ABC、3TC和FTC,发生耐药的平均时间约为47个月。4.发现中国云南省主要流行毒株是CRF08_BC、CRF07_BC以及CRF01_AE。发现B亚型序列与贵州地区的B亚型亲缘性关系更近;发现C亚型序列与印度C亚型及云南C亚型亲缘关系较近。本研究结果为监测HIV/AIDS流行、干预传播、优化抗病毒治疗方案和设计疫苗提供了科学依据。