编者按：
原文：Nonokawa M , Shimizu T , Yoshinari M , et al. Association of neutrophil extracellular traps with the development of idiopathic osteonecrosis of the femoral head[J]. American Journal Of Pathology, 2020.
中性粒细胞胞外陷阱与
特发性股骨头坏死的关系
特发性股骨头坏死（ONFH）被定义为由于股骨头的非创伤性局部缺血引起的骨细胞坏死。医源性糖皮质激素的使用和习惯性饮酒被认为是危险因素。有人认为，糖皮质激素诱导血小板活化导致股骨头的局部血流紊乱，活化的血小板和酒精都可以诱导中性粒细胞外网状陷阱（NETs）。为了确定NETs与特发性ONFH发展的关联，通过免疫荧光染色评估了手术切除的特发性ONFH和骨关节炎患者的股骨头中是否存在形成NET的中性粒细胞。结果表明有NET形成的中性粒细胞存在于特发性ONFH患者股骨头周围的小血管中，但不存在骨关节炎患者中。此外向实验大鼠静脉内注射形成NET的中性粒细胞和无NET诱导的中性粒细胞，然后通过免疫化学组织评估股骨头周围组织的缺血状态。结果显示有NET形成的中性粒细胞循环进入股骨头周围的组织，组织中缺氧诱导因子-1α的表达高于静脉注射中性粒细胞而无NET诱导的大鼠。此外，在静脉内注射形成NET的中性粒细胞的大鼠的股骨头中观察到了骨细胞的缺血变化。最终研究结果表明，NETs可能与特发性ONFH的发生有关。
最近的研究表明，除了一定的遗传背景外，股骨头供血不足、脂质代谢的影响、成骨作用的减少以及骨细胞的凋亡都可能与使用糖皮质激素相关。目前已经明确了糖皮质激素诱导血小板活化对股骨头循环障碍的影响。同时，已经有研究表明，过量饮酒会降低成骨细胞的分化能力。由于所有滥用酒精的患者并不是都会发展为ONFH，因此认为某些遗传因素也与酒精性ONFH的易感性有关。
中性粒细胞胞外网状陷阱（NETs）是由活化的中性粒细胞释放的网状结构，其由未分解的DNA和细胞质抗菌蛋白组成。NETs可以通过网状DNA捕获微生物，通过抗菌蛋白杀死它们，从而阻止宿主传播。尽管NETs在先天免疫中起着至关重要的作用，但是NETs的过度形成可能是微血管病变的原因。活化的血小板和酒精均可诱发NETs。因此，我们假设如果在股骨头周围的小血管中存在释放NETs的中性粒细胞，则这些细胞可能与特发性ONFH的发生有关。
在这项研究中，我们首先通过免疫荧光染色检查确定了特发性ONFH和骨关节炎（OA）标本股骨头周围小血管中形成NETs的中性粒细胞存在。如预期所想，有NETs形成的中性粒细胞存在于特发性ONFH股骨头周围的小血管中，而OA患者中则不存在。接下来，将形成NETs的中性粒细胞通过静脉注入大鼠体内，以确定股骨头周围小血管中的NETs是否可以诱导组织缺血。研究表明，NETs会被血清酶（包括DNase I）降解，血清DNase I活性受年龄衰老影响。因此，在进行静脉注射后，比较了成年（4周龄）和老年（24周龄）大鼠的血清NETs的降解能力。有趣的是，老年高龄大鼠的血清NETs降解能力明显低于幼龄成年大鼠。基于这些发现，将有NETs形成的中性粒细胞静脉内注射入老年大鼠中。这项研究表明静脉注射形成NETs的中性粒细胞通过循环进入股骨头周围的组织，并表明其可诱发股骨头缺血进而发生坏死。
材料和方法
本研究使用了从2018年4月至2019年10月在北海道大学医院骨外科进行全髋关节置换术手术患者的股骨头（50至87岁）。这些股骨头来自14名特发性ONFH患者（50至86岁；6名女性）和12名OA患者（52至87岁；7名女性）。特发性ONFH和OA患者之间的年龄和性别差异无统计学差异（表格1）。
在14例ONFH患者中，有4例与糖皮质激素药物相关，2例与酒精滥用相关，8例与两者均相关（补充表S1）。需要糖皮质激素治疗的基础疾病包括：溃疡性结肠炎、疱疮、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病、肺曲霉菌病、全身性硬化症、类风湿性关节炎、药物诱发的超敏综合症、嗜酸性肉芽肿和多血管炎、骨髓移植后的移植物抗宿主病、多发性肌炎、IgA肾炎等。所有患者均获得书面知情同意。该研究得到北海道大学医院伦理委员会的批准（批准号018-0075）。
病理诊断
切除的股骨头用10％福尔马林固定，然后在10％EDTA-2Na溶液中脱钙。几个月后，用肉眼确定股骨头冠状切片中是否存在坏死。之后，通过显微镜肉眼确认宏观判断。
有NETs形成的中性粒细胞的免疫荧光染色
为了确定在股骨头周围的小血管中是否存在形成NETs的中性粒细胞，在脱钙前先对附着在股骨头上的滑膜结缔组织取样。然后将福尔马林固定的结缔组织样品包埋在石蜡中。将这些福尔马林固定石蜡包埋的组织进行切片（4mm厚），然后用二甲苯脱蜡。将脱蜡的切片用Tris-EDTA缓冲液（pH 9.0）于121°C高压灭菌20分钟，以回收抗原，然后将其浸入无蛋白血清（Dako，Glostrup，Hovedstaden，Denmark）中10分钟，以避免非特异性反应。此后，使切片首先与山羊抗人髓过氧化物酶（MPO）抗体（1：200稀释；R＆D Systems，Minneapolis，MN）在4°C反应过夜，然后与兔抗人瓜氨酸化组蛋白H3抗体（1：100）反应稀释; Abcam，Cambridge，MA）作为NETs标记。在室温下放置60分钟。然后使切片与Alexa Fluor 488偶联的驴抗山羊IgG抗体（1：500稀释; Abcam）和Alexa Fluor 594偶联的驴抗兔IgG抗体（1：500稀释; Abcam）于室温下在黑暗环境中反应60分钟。最后，将切片用带有DAPI的VECTASHIELD固 定 介 质（ Vector Laboratories ，Burlingame，CA）固定并使用荧光显微镜下观察。
老鼠
购自Sankyo Laboratory（日本札幌）的雄性WistarKyoto（WKY）大鼠（成年4周；高龄24周）。根据《护理指南》进行的大鼠实验经过北海道大学实验动物处的许可（许可号15-0034）。
大鼠血清净降解能力的测定
将健康志愿者的外周血中性粒细胞接种在四孔载玻片的孔中（1×106 细胞/ mL）。将细胞在37℃下暴露于100nmol/L的phorbol12-myristate 13-acetate（PMA；Sigma-Aldrich，St.Louis，MO）4小时以诱导NETs。用磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤后，将样品在10％的成年（4周龄）WKY大鼠（n＝5）和高龄（24周龄）WKY大鼠（n＝5）的血清中温育。在37°C下培育30分钟之后，将样品用PBS洗涤，然后在室温下用4％多聚甲醛固定15分钟。用PBS洗涤后，将其余样品与含DAPI的溶液固定在一起。随机拍摄显微照片（放大倍数为200）（每孔六个视野）。使用ImageJ软件1.50i版（NIH，Bethesda，MD），然后按照标准所述计算NETs的降级率（百分比）。使用志愿者外周血经过北海道大学保健科学部伦理委员会批准（许可编号18-34）。
大鼠腹腔中性粒细胞的收集
给WKY大鼠（4周龄）进行腹腔注射。注射3％巯基乙酸盐（Becton Dickinson），诱发腹膜炎。48小时后，通过冲洗腹腔收集渗入腹膜的炎性细胞，然后将洗出的细胞重悬于含有1mmol/L 的EDTA的PBS中。中性粒细胞占收集细胞的90％以上。
NET的诱导和形成NET的中性粒细胞的收集
将收集的细胞重悬于补充有10％胎牛血清的RPMI 1640培养基中，然后接种到10cm培养皿中（1×106细胞/ mL）。然后在37℃下将细胞暴露于100nmol/ L PMA 4小时以诱导NETs。用PBS洗涤后，使用细胞刮刀收集残留在培养皿中的物质，其中含有大量可形成NETs的中性粒细胞，然后将其重悬于PBS中。
有NETs形成的中性粒细胞注入大鼠
通过尾静脉分两次向老年（24周龄）WKY大鼠（组1；n＝6）注射含有大量NETs的中性粒细胞的物质，间隔1周。作为对照，将从患有腹膜炎的大鼠的腹腔中收集的细胞同方式注射到老年（24周龄）的WKY大鼠中（组2；n＝4），其中性粒细胞无NET诱导。最后一次注射后的一周，将所有大鼠处死进行组织病理学评估。
组织病理学评估
切除全身器官和股骨头周围的结缔组织，将福尔马林固定石蜡包埋的组织切成薄片（4mm），用二甲苯脱蜡，然后进行苏木精和伊红染色。对股骨头周围的结缔组织切片进行了NETs免疫荧光染色和缺氧诱导因子1a（HIF-1a）的免疫组织化学染色。HIF-1a的免疫组织化学处理方法如下：将福尔马林固定石蜡包埋的切片在121°C高压下灭菌。用Tris-EDTA缓冲液（pH 9.0）提取10分钟以回收抗原，然后将其暴露于补充有3％过氧化氢的甲醇中10分钟以消耗组织中的内源性过氧化物酶。用10％山羊血清阻断抗体的非特异性反应后，将切片与小鼠抗人HIF-1a抗体（1：800稀释；Abcam）反应，在室温下可与大鼠HIF-1a交叉反应60分钟。用PBS冲洗未结合的抗体后，接下来使这些切片与辣根过氧化物酶结合的山羊抗小鼠IgG抗体（1:50稀释；Abcam）在室温下反应60分钟。用二氨基联苯胺测定辣根过氧化物酶活性。
统计分析
卡方检验用于比较两组之间的频率差异。U检验用于比较两个非参数组之间的值。P <0.05被认为具有统计学意义。
结果
股骨头冠状切面的宏观和微观发现
切除的股骨头用10％福尔马林固定，然后在10％EDTA-2Na溶液中脱钙。几个月后，用肉眼确定了股骨头冠状切片中是否存在骨坏死。在特发性ONFH患者的股骨头冠状切片中观察到明显的坏死（图1A）。骨关节炎患者的股骨头的冠状切片没有明显坏死（图1C）。之后，这些宏观发现在显微镜下得到了确认（图1，B和D）。
股骨头周围小血管中形成网状嗜中性粒细胞
将附着在股骨头上的滑膜结缔组织(图2A)在脱钙之前取样，并进行苏木精和伊红染色以及有NETs形成的中性粒细胞的免疫荧光染色。
图2 股骨头周围小血管中嗜中性粒细胞形成的细胞外陷阱。A:含有附着在股骨头(箭头)上的滑膜的结缔组织，进行免疫荧光染色。B:股骨头周围组织中NETs中性粒细胞(箭头)的典型发现，显示股骨头特发性坏死。C:股骨头周围组织的代表性发现显示骨关节炎。观察到髓过氧化物酶阳性细胞(箭头)，但未观察到NETs中性粒细胞。比例尺50毫米(带宽)。CitH3：瓜氨酸化组蛋白H3。
在所有14例特发性ONFH中，通过瓜氨酸化组蛋白H3（NETs标记物）的共同定位确定了形成NETs的中性粒细胞），MPO和DAPI（DNA标记）被发现在股骨头周围的小血管中（图2B），而在苏木精和伊红标本中未发现血栓。相反，在所有12例骨关节炎患者的股骨头周围的小血管中观察到髓过氧化物酶细胞，但没有观察到有NETs形成的中性粒细胞(图2C)。
特发性股骨头坏死和骨关节炎之间股骨头周围小血管中NETs中性粒细胞的存在有统计学上的显著差异(卡方检验，P＝3.4×10-7)(表2)。
老年大鼠的血清净降解能力低于成年幼鼠
比较了成年（4周龄）和老年（24周龄）WKY大鼠的血清NETs降解能力。简而言之，将在37℃下由PMA在人外周血中性粒细胞上诱导的NETs暴露于10％大鼠血清中30分钟，然后通过图像定量分析残留的NETs。结果发现老年大鼠的血清NETs降解能力明显低于幼龄大鼠（图3)。
图3 嗜中性粒细胞胞外陷阱降解试验
静脉注射网状中性粒细胞大鼠
股骨头周围组织中网状中性粒细胞的循环
根据血清NETs降解试验的结果，将形成NETs的中性粒细胞通过尾静脉注射入老年（24周龄）WKY大鼠（第1组；n＝6）两次，间隔1为周。为此，PMA刺激从患有腹膜炎的WKY大鼠腹腔收集的细胞在培养皿中诱导NETs。通过用PBS洗涤除去PMA后，将含有大量形成NET的中性粒细胞的残留物质注射到大鼠中。作为对比，将从腹膜炎大鼠腹腔收集的细胞类似地注射到不经NETs诱导的高龄（24周龄）WKY大鼠（第2组；n＝4）中。在第1组中，在所有6只大鼠（8/12条腿）的股骨头左或右结缔组织的小血管中发现了形成NETs的中性粒细胞（图4A）。在第2组中，在股骨头（0/8腿）周围的小血管中观察到MPO细胞，但未观察到形成NET的中性粒细胞（图4B）。第1组和第2组之间，在股骨头周围的小血管中形成NETs的中性粒细胞存在统计学差异（卡方检验，P＝0.0029）（表3)。
图4 中性粒细胞细胞外陷阱(NETs)形成的嗜中性粒细胞向Wistar Kyoto (WKY)大鼠股骨头周围组织的循环，给其静脉注射NETs形成的嗜中性粒细胞。A:WKY大鼠股骨头周围组织中NETs中性粒细胞的代表性发现(第1组)。一簇NETs中性粒细胞被虚线包围。WKY大鼠经静脉注射中性粒细胞而无NETs诱导的代表性发现(第2组)。观察到髓过氧化物酶阳性细胞(箭头)，但未观察到NETs中性粒细胞。比例尺50毫米(A和B)。CitH3：瓜氨酸化组蛋白H3。
静脉注射形成NETs中性粒细胞的
大鼠股骨头缺血性改变
为了确定静脉注射有NETs中性粒细胞的WKY大鼠股骨头缺血状态，检测了附着在股骨头上的结缔组织中缺氧诱导因子-1的表达。结果表明，与组2相比，组1股骨头周围结缔组织的血管平滑肌细胞中缺氧诱导因子-1的表达较高(图5，A和B)。
相应地，尽管在股骨头周围的结缔组织中没有发现血栓，但在第1组(2/12只腿)的两只大鼠的两条腿中观察到股骨头中骨细胞的缺血性变化，表现为苏木精核染色的减少(图5，C和E)。第2组(0/8条腿)股骨头骨细胞缺血性改变不明显(图5，D和F)。虽然第1组和第2组之间没有统计学上的显著差异(卡方检验，P＝0.22)(表4)，但集体研究发现表明股骨头周围小血管中形成NETs的中性粒细胞与股骨头缺血有关。
讨论
在这项研究中，我们首先证明了特发性股骨头坏死患者股骨头周围的小血管中存在网状中性粒细胞，而非骨关节炎患者。据认为，股骨头坏死是由于软骨下微循环受损而形成的。由于NET的免疫荧光染色方法的局限性，首选组织切片而不脱钙，因此在股骨头周围的结缔组织中评估了小血管，而不是骨中的软骨下小血管。结果表明，特发性ONFH与病变附近小血管中形成NET的中性粒细胞有关。然而，形成NET的中性粒细胞是否参与特发性ONFH的发展或是否是该疾病的结果却难以捉摸。因此，随后计划进行了动物实验。
建立了多种特发性股骨头坏死动物模型，包括糖皮质激素诱导的大鼠、小鼠、兔、鸡、猪和鸸鹋股骨头坏死(reviewed by Xu et al)和酒精诱导的股骨头坏死(大鼠、山羊、犬)。虽然这些模型模拟了特发性股骨头坏死的临床特征，但我们设计了一个简单的诱导模型来确定网状中性粒细胞对股骨头坏死发生的直接贡献。为此，采用了通常用于血管研究的近交野生型WKY大鼠，这些血管研究侧重于血管动力学和血管炎症方向。
静脉注射入WKY大鼠的NETs中性粒细胞循环到股骨头周围组织，组织中缺氧诱导因子-1的表达高于对照组。相应地，在一些注射了形成NETs的中性粒细胞的大鼠中观察到股骨头骨细胞的缺血性改变，表现为苏木精核染色的减少。已经证实缺氧诱导因子-1的表达是由组织缺氧诱导的。根据这些发现，我们认为神经内分泌干扰物可能与股骨头局部血流障碍和缺血有关。然而，除神经内分泌干扰物外的因素也可能参与股骨头坏死的发病机制，因为在大鼠中没有观察到导致股骨头破坏的骨细胞的明显坏死。
在股骨头坏死患者或静脉注射NETs中性粒细胞的大鼠的股骨头周围的结缔组织中未发现明显的血栓。虽然NETs与血栓形成有关，但除血栓形成外的机制(如小血管痉挛和NETs介导的内皮细胞损伤)可能与组织缺血有关。需要进一步的研究来确定小血管中形成NETs的中性粒细胞如何导致组织缺血。
形成NETs的中性粒细胞似乎没有被招募到股骨头周围的组织中，因为NETs沉积在大鼠小血管壁的结缔组织中(补充图S1)。这些发现表明静脉注射的有NETs形成的中性粒细胞在大鼠体内循环。然而，某些解剖学因素与股骨头局部血流障碍相关的可能性也不能被排除。
在这项研究中显示瓜氨酸化组蛋白H3、MPO和DAPI共定位的细胞被认为是形成NETs的中性粒细胞。然而，这些细胞可能包括形成细胞外陷阱的单核细胞，因为单核细胞也含有MPO，且已经显示出形成类似于中性粒细胞的细胞外陷阱。需要进一步的研究来鉴定瓜氨酸化组蛋白H3，MPO，DAPI定位的细胞可视作形成NETs的中性粒细胞。
活体内的NETs的数量被估计为新生和退化的平衡。NETs的产生是由感染性刺激(如脂多糖)在生理上诱导的。在病理条件下，激活中性粒细胞的多种因素，包括炎性细胞因子和自身抗体，可以诱导NETs。这些NETs诱导因子通常与自身免疫性疾病有关，这些疾病是糖皮质激素治疗的目标。此外，有证据表明，在患有自身免疫性疾病(包括系统性红斑狼疮)的患者中，易于产生NETs的低密度粒细胞的数量增加。因此，有人认为，患有糖皮质激素相关的非酒精性脂肪性肝炎的患者由于潜在的疾病而易于产生NETs。需要进一步的研究来阐明糖皮质激素如何增强不同自身免疫性疾病患者中性粒细胞上的净形成。BuKong等人最近证明酒精可以在体外诱导NETs。因此，也有人认为，出现酒精相关ONFH的患者容易产生NETs。
净降解的两个主要机制是血清脱氧核糖核酸酶I的消化和巨噬细胞的传出细胞增多。已经证明，在患有自身免疫性疾病(包括系统性红斑狼疮和多血管炎)的患者血清中，净降解能力较低。此外，系统性红斑狼疮中的传出细胞增多症的损害已被证实。有趣的是，酗酒诱导小鼠巨噬细胞传出细胞增多症的减少。特发性股骨头坏死患者中NETs净降解障碍的问题是未来研究的关键主题。
结论
特发性股骨头坏死发生在具有遗传易感背景的患者中，这些患者暴露于致病的环境因素中。这项研究表明NETs与特发性股骨头坏死的发生有关，并促进了对相关病理生理学的进一步研究了解。
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