摘要： 背景：冠心病是严重危害人类健康的常见病和多发病，其病理基础是动脉粥样硬化(Atherossclerosis，AS)。研究表明AS是一个稳定期和不稳定期交替的非线性过程，这一过程取决于斑块的易损性。易损斑块(Vulnerable Plaque)可导致斑块破裂和血栓形成，临床上表现为急性冠状动脉综合征(Acute CoronarySyndrome，ACS)。因此，对于动脉粥样硬化早期诊断、稳定和消退斑块具有重要的临床意义。 已经证实AS是一个多种致病因素导致的血管壁发生级联反应的慢性炎症过程。炎性因子标志物对ACS的诊断作用引起了国内外许多学者的关注，如：高敏C反应蛋白(hsC-RP)、细胞间黏附因子-1(ICAM-1)、细胞血管间黏附因子-1(VCAM-1)、基质金属蛋白酶(MMPs)等。晚近，关于妊娠相关血浆蛋白A(PAPP-A)的研究发现，PAPP-A与斑块的炎性活动存在相关性，有可能作为斑块炎性活动的重要评价指标。 以往的研究表明，他汀类和ACEI类药物具有稳定斑块的作用。近年来，随着临床研究结果的公布β-受体阻滞剂和钙拮抗剂对动脉粥样硬化斑块的消退作用引起很多学者关注，但是具体作用机制尚不完全清楚。研究证实中药复方丹参滴丸可以影响脂质的代谢，但其对动脉粥样硬化斑块稳定和消退的作用机制尚需进一步研究。因此，本研究拟将复方丹参滴丸、美托洛尔、卡维地洛和氨氯地平用于兔动脉粥样硬化模型中，观察这些药物对斑块稳定和消退的疗效并探讨其分子生物学机制。 目的： 1．观察复方丹参滴丸、美托洛尔、卡维地洛、氨氯地平对动脉粥样硬化斑块的消退和稳定作用并探讨其分子生物学机制。 2．探讨新型炎性因子PAPP-A在预测动脉粥样硬化易损斑块中的作用。 研究方法： 1．模型的建立：60只雄性新西兰纯种大白兔，应用球囊损伤腹主动脉，高胆固醇(1％)饲养12周。12周末，随机分成六组，分别为小剂量复方丹参滴丸组(5粒/天/只)、大剂量复方丹参滴丸组(10粒/天/只)、美托洛尔组(25毫克/天/只)、卡维地洛组(15毫克/天/只)、氨氯地平组(5毫克/天/只)、自然消退组，同时改为普通饮食。24周末各组分别在腹主动脉动脉粥样硬化斑块处转染100μl 2.245×10<'9>pfu/ml的Ad-p53重组载体。25周末，给予各组实验兔中国斑点蝰蛇毒(Chinese Russell's viper venom，CRVV)以及组胺进行药物触发，以促进斑块破裂。 2．血液生化指标及炎性因子的检测：各组实验兔分别于实验开始、12周末和24周末，于清晨空腹称重后，经腹壁静脉采血，检测总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)。于实验开始、12周末和25周末测量血液中一氧化氮(NO)、超氧化物岐化酶(SOD)和丙二醛(MDA)的水平。应用酶联免疫吸附法(ELISA)测定hsC-RP、PAPP-A的水平。 3．高频超声检查：各组实验兔分别于实验开始、12周末和25周末应用体表超声检测腹主动脉收缩期内径(Ds)、内膜-中层厚度(IMT)、腹主动脉血流峰值速度(Vp)、血流剪切率(SR)和声学密度(AIIc％)。 4．血管内超声检查：各组实验兔分别于24周末和处死前应用血管内超声技术测量血管外弹力膜面积(EEMA)、管腔面积(LA)和斑块面积(PA)，同时根据PA和EEMA计算管腔面积狭窄百分比(LAS％)。 5．组织病理学检测：观察基因转染部位斑块破裂及血栓形成的发生率，测量易损斑块处血管重构情况。利用HE和油红O染色，观察斑块的形态学特征，镜下测量纤维帽及内中膜的厚度；masson染色观察斑块内部胶原纤维分布状况；应用妊娠血浆相关蛋白A(PAPP-A)、细胞间黏附因子-1(ICAM-1)、细胞血管间黏附因子-1(VCAM-1)、基质金属蛋白酶-1(MMP-1)、金属蛋白酶组织抑制物(TiMP-1)的单克隆抗体、RAMll单克隆抗体和α-actin单克隆抗体对腹主动脉粥样硬化斑块进行组织免疫组织化学染色，以明确斑块处各个炎性因子的表达以及巨嗜细胞和平滑肌激动蛋白的分布情况。电镜观察斑块内皮细胞和平滑肌细胞的结构。 6．实时定量PCR技术：检测各组实验兔腹主动脉粥样硬化斑块处VCAM-1、ICAM-1、MMP-1和TIMP-1的mRNA表达水平。 7．免疫印迹(Westem blot)技术：检测各组实验兔腹主动脉粥样硬化斑块处VCAM-1、ICAM-1、MMP-1和TIMP-1的蛋白质表达情况。 8．斑块易损性的危险性分析：Logistic回归分析对斑块破裂组和未破裂组的体重、血清学指标、体表超声指标、AD值、IVUS测值等指标分析进行多变量Logistic回归分析，以筛选斑块易损性的预测指标。 9．统计学分析：所有数据均采用x±s表示，采用SPSSl3.0分析软件，计量资料采用t检验及方差分析，三组以上均数有显著性差异时，采用两两比较q检验；变量之间的相关关系采用直线回归相关分析，以P<0.05为有统计学意义。 结果： 1．模型的建立：60只新西兰大白兔经过球囊拉伤以及高脂饮食(1％)12周后，共有8只动物意外死亡。有52只新西兰大白兔进入药物干预阶段，小剂量复方丹参滴丸组有9只，大剂量复方丹参滴丸组9只，卡维地洛组9只，美托洛尔组8只，氨氯低平组9只，自然消退组8只。24周术，各组实验兔的存活情况为：小剂量复方丹参滴丸组8只，大剂量复方丹参滴丸组9只，卡维地洛组7只，美托洛尔组8只，氨氯地平组8只，自然消退组7只。死亡原因分别为：麻醉意外、腹泻、感染或者原因不明。 2．各组实验兔体重：12周末实验兔体重比基础状态增加(P<0.01)，24周术各组体重与12周末比较差异无统计学意义(P>0.05)。 3．血脂水平：与自然消退组比较，氨氯地平组、大剂量复方丹参滴丸组、卡维地洛组和美托洛尔组TC和LDL-C显著降低(P<0.05)，小剂量复方丹参滴丸组有降低趋势，未达到统计学意义：TG降低仅氨氯地平组降低达到统计学差异(P<0.05)；大剂量复方丹参滴丸组和氨氯地平组HDL-C升高达到统计学意义(P<0.05)，美托洛尔组HDL-C降低达到统计学意义(P<0.01)。 4．血液指标：与自然消退组相比较，各治疗组hsC-RP和MDA都有不同程度降低(P<0.05)；SOD和NO各组都有不同程度的升高(P<0.05)，其中以大剂量复方丹参滴丸组最为明显。 5．体表超声：与自然消退组比较，各治疗组仅有小剂量复方丹参滴丸组IMT未达到统计学意义的降低(P>0.05)，降低幅度由大到小依次为氨氯地平组、卡维地洛组、大剂量复方丹参滴丸组、美托洛尔组、小剂量复方丹参滴丸组和自然消退组：美托洛尔组和卡维地洛组Vp降低达到统计学意义(P<0.01)；AIIc％各组升高均达到统计学意义(P<0.05)，以美托洛尔组升高最明显；SR仅美托洛尔组降低达到统计学意义(P<0.05)，而复方丹参滴丸组由增加的趋势，其中小剂量复方丹参滴丸组达到统计学意义(P<0.05)。 6．血管内超声：与自然消退组比较，各治疗组LAS％明显下降(P<0.05)。药物触发后，自然消退组斑块破裂4例，破裂率57％；小剂量丹参滴丸组破裂3例，破裂率37％；大剂量丹参滴丸组2例，破裂率22％；美托洛尔组2例，破裂率25％，氨氯地平组2例，破裂率25％；卡维地洛组1例，破裂率14％。 7．病理学结果：与自然消退组比较，各治疗组ICAM-1、VCAM-1、MMP-1、FIMP-l和RAMll的表达均减少，而a-actin的表达增加；各治疗组油红O着色比自然消退组浅；与自然消退组比较，各个治疗组纤维帽的厚度都有不同程度的升高(P<0.05)由大到小依次为美托洛尔组、大剂量复方丹参滴丸组、小剂量复方丹参滴丸组、氨氯地平组、卡维地洛组和自然消退组；内中膜厚度不同程度的减少(P<0.05)。 8．实时定量PCR检测：与自然消退组比较，各治疗组ICAM-1、VCAM-1、MMP-1、TIMP-1的mRNA表达都有不同程度的减少(P<0.01)。 9．免疫印迹(Western blot)检测：与自然消退组比较，各治疗组ICAM-1、VCAM-1、MMP-1、lIMP-1都有不同程度的减少。 10.PAPP-A相关性分析：PAPP-A与血液hsC-RP、血管内超声LAS％以及腹主动脉IMT相关，其相关系数R<'2>分别为0.424、0.112和0.339，其P值均小于0.01。 11.斑块易损性的危险性分析：Logistic回归结果显示IVUS测值PA，血清指标PAPP-A和hsC-RP，以及斑块的IMT与斑块破裂关系密切，是预测斑块易损性的重要指标。 结论 1．在动脉粥样硬化斑块兔模型中，氨氯地平、美托洛尔、卡维地洛和复方丹参滴丸可以起到稳定和消退斑块的作用，以氨氯地平作用最佳。 2．斑块内脂质的减少、巨嗜细胞分布减少、抑制氧化应激和炎症因子的表达是四种药物消退实验兔动脉粥样硬化斑块的主要机制；调节脂质代谢、抑制炎性反应、减少血流速度、调节血流剪切率是药物稳定实验兔动脉粥样硬化斑块的主要机制。 3．复方丹参滴丸主要通过调节血脂、抑制氧化应激和炎症因子的表达稳定和消退动脉粥样硬化斑块。美托洛尔和卡维地洛主要通过降低血流剪切率、巨嗜细胞分布减少和调节炎症因子的表达稳定和消退动脉粥样硬化斑块。氨氯地平作用较广泛，调节血脂、减少巨嗜细胞的分布、抑制氧化应激和炎症因子的表达。 4．高频超声检查可作为动态观察动脉粥样硬化斑块的变化、识别斑块破裂的可靠性方法。 5．PAPP-A与IMT、hsC-RP以及LAS％相关，可以作为动脉粥样硬化斑块不稳定性的检测指标之一。
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