温肾阳与降相火对雌性大鼠生殖内分泌功能调控的实验研究

【摘要】： 大量的中西医结合基础研究及临床研究证明,下丘脑-垂体-性腺轴的功能活动与中医肾主生殖的功能相似。补肾治疗对女性性腺轴功能具有双相调节作用,能够使下丘脑-垂体-性腺轴的功能得以改善。中药的类激素样作用,而不是代替激素的作用,可能正是中医药调节生殖内分泌的特点和意义所在。 从古代文献的整理中,我们发现:古人对孕育的认识,除强调阴血的充盛外,非常重视阳气的作用。在物质与功能孰先孰后的关系上,古人认为火(气)在先,精在后,先天命门火气是形成胚胎的原动力。因此,古代种子方药中,主要以温补为主,印证了中医“暖则生物、冷则杀物”的理论。 为进一步探讨“暖则生物、冷则杀物”的科学性,我们选用温肾助阳的代表方右归丸和滋阴降相火的代表方知柏地黄丸,从整体、细胞水平研究温肾阳与降相火对雌性大鼠生殖内分泌的影响及其作用机制,以丰富和发展中医妇科生殖生理理论,并为科学用药提供依据。本课题主要做了以下两方面的工作: 1文献研究 通过对古代文献的整理和古代种子方剂用药规律的研究,我们得出以下结论: 1.1孕育的基础 提出父精母血为孕育之基,在絪缊的侯择时种子,并强调受孕的宜忌,天气、环境、情绪等对孕育均有影响。 1.2孕育的条件 肾气充盛,天癸泌至,阴阳和畅,气血旺盛,真火先会,精聚成胎。受孕还应注意必当其年,不可过纵。 1.3影响孕育的因素 肾虚、宫寒、气血薄弱、痰湿闭塞、肝气郁滞、血瘀、相火旺等因素均可影响孕育。 1.4种子大法 包括种子必先调经,经调则子嗣;调和阴阳,万物化生;暖则生物,勿折真火等大法。 1.5古代种子方剂用药规律 在治疗上重视肾与生殖的密切关系,药物以入肾经为主。具体治法以调补气血为主,强调气血与胎孕的联系。药物性味以甘、辛、温热药居多,用药偏于温补,主要受“暖则万物生发,冷则万物肃杀”的“天人相应”观的影响。 2实验研究 2.1温肾阳与降相火对雌性大鼠下丘脑-垂体-性腺轴的影响 2.1.1温肾阳与降相火对子宫、卵巢组织形态学的影响 探讨温肾阳与降相火对大鼠子宫内膜厚度、卵泡数量的影响。将62只10-12周龄SD大鼠随机分空白对照、右归丸小剂量、右归丸大剂量、知柏地黄丸小剂量、知柏地黄丸大剂组五组。各组给药8周后,采用组织病理学方法,测量子宫内膜厚度、双侧卵巢卵泡数。结果:右归丸大剂量组子宫内膜明显增厚,与空白对照组和知柏地黄丸大、小剂量组比较,有显著差异(P0.05)。右归丸大剂量组双侧卵巢卵泡数明显增多,与空白对照组和知柏地黄丸大、小剂量组比较,有显著差异(P0.05)。右归丸小剂量组卵泡数与知柏地黄丸大剂量组比较,明显增多,有显著差异(P0.05)。知柏地黄丸大剂量组双侧卵巢卵泡数明显减少,与空白对照组比较,有显著差异(P0.05)。 2.1.2温肾阳与降相火对垂体-卵巢促性腺激素、性激素的影响 探讨温肾阳和降相火对垂体分泌卵泡刺激素(follicle stimulating hormone releasing hormone ,FSH)、黄体生成激素(luteinizing hormone ,LH)和卵巢分泌雌二醇(estradiol ,E2)、孕酮(progesterone ,P)、睾酮(testosterone ,T)的影响。采用放射免疫法测定各组大鼠E2、P、T、LH、FSH的含量。结果:知柏地黄丸大剂量组与空白对照组和右归丸大、小剂量组比较,E2水平降低,有显著差异(P0.05)。知柏地黄丸小剂量组与右归丸大、小剂量组比较,E2水平降低,有显著差异(P0.05)。右归丸大、小剂量组与空白对照组比较,E2水平均有升高,但无显著差异(P0.05)。知柏地黄丸大剂量组,P水平明显下降(P0.05)。各组T水平无显著差异。右归丸大剂量组血FSH明显升高,与空白对照组、右归丸小剂量组、知柏地黄丸大小剂量组比较,有显著差异(P0.05)。各组LH水平无显著差异。 2.1.3温肾阳与降相火对下丘脑GnRH含量的影响 采用免疫组化法,测量下丘脑灰度值(gray value Average)及吸光度(Optical density Average)。结果:右归丸大剂量组下丘脑GnRH灰度值与空白对照组比较,差异无显著性(P0.05),知柏地黄丸小剂量组下丘脑GnRH灰度值明显高于空白对照组,差异有显著性(P0.05),知柏地黄丸大剂量组下丘脑GnRH灰度值明显高于空白对照组,差异有极显著性(P0.001)。知柏地黄丸大、小剂量组与右归丸大、小剂量组比较,GnRH灰度值明显增高,差异有极显著性(P0.001)。 右归丸小剂量组与空白对照组比较,下丘脑GnRH吸光度明显增高,差异有显著性(P0.05)。右归丸大剂量组与空白对照组比较,下丘脑GnRH吸光度明显增高,差异有极显著性(P0.001)。知柏地黄丸大、小剂量组与空白对照组比较,GnRH吸光度明显降低,差异有极显著性(P0.001)。右归丸大、小剂量组与知柏地黄丸大、小剂量组比较,GnRH吸光度明显增高,差异有极显著性(P0.001)。 2.1.4温肾阳与降相火对子宫内膜雌激素受体α(estrogen receptor ,ERα)的影响 采用免疫组化法,测量子宫灰度值及吸光度。各组子宫内膜ERα的灰度值和吸光度比较,差异无显著性(P0.05)。 2.2温肾阳与降相火对大鼠卵巢颗粒细胞(granulose cell ,GC)增殖与分泌功能的影响 2.2.1温肾阳与降相火对大鼠卵巢GC体外增殖的影响制备大鼠卵巢GC,右归丸和知柏地黄丸分别设5、10、20、40、80、160、320μg /100μl七个梯度,培养24小时后采用MTT法测定不同浓度的药物对GC增殖的影响。结果:右归丸水提液能促进体外培养GC的生长,随浓度的增加,其作用更加明显。知柏地黄丸水提液抑制GC的生长,随浓度的增加,其抑制作用更强。 2.2.2温肾阳与降相火对大鼠卵巢GC体外分泌功能的影响制备大鼠卵巢GC,右归丸和知柏地黄丸分别设5、10、20、40μg /100μl四个梯度。体外培养24小时后采用放射免疫法测定细胞上清液E2、P含量。结果:GC上清液中的E2含量,以右归丸大剂量组最高,与空白对照组比较,差异有显著性(P0.05)。知柏地黄丸10μg /100μl和40μg /100μl组最低,与空白对照组比较,差异有显著性(P0.05)。GC上清液中的P含量,以右归丸10μg /100μl、20μg /100μl和40μg /100μl组最高,与空白对照组比较,差异有显著性(P0.05)。知柏地黄丸5μg /100μl和40μg /100μl组最低,与空白对照组比较,差异有显著性(P0.05)。 2.2.3结论: (1)温肾阳能明显增加子宫内膜厚度及卵泡数;降相火对子宫内膜厚度无影响,但显著降低卵泡数。 (2)温肾阳能升高血清FSH水平,进一步对血清E2水平有升高的趋势;降相火对血清FSH水平无影响,但能直接降低血清E2和P水平。两者对血清T和LH的影响不大。 (3)温肾阳能促进下丘脑分泌GnRH;降相火抑制下丘脑分泌GnRH。 (4)温肾阳和降相火对子宫内膜ERα的含量无影响。 (5)温肾阳可促进体外培养的GC增殖及分泌功能;降相火则抑制体外培养的GC增殖及分泌功能。 总之,通过本实验,我们不难看出温肾阳对下丘脑-垂体-性腺轴起上调的作用,降相火对下丘脑-垂体-性腺轴起下调的作用。并且,温肾阳可能通过促进GC的增殖及分泌功能,进而促进卵子的发育,对生殖产生有利的影响。降相火可能通过抑制GC增殖及分泌功能,影响卵子的发育,对生殖产生不利的影响。验证了“暖则生物、冷则杀物”的科学性。