这是一种非放射性标记技术。主要利用了生物素（biotin）和亲和素（avidin）这两种分子的独特性质。亲和素是一种碱性的四聚体糖蛋白，其分子量为68000，pI10.5。每个亚基都能结合一个生物素分子。生物素与亲和素的结合只需要生物素的脲基环部分。因此可将其戊酸侧链通过酰胺键与核酸分子相连，构成生物素标记的核酸探针、标记探针与固定在滤膜（硝酸纤维素滤膜或尼龙膜）上或固定在组织细胞或染色体原位的核酸分子的同源序列互补杂交。探针和待侧核酸在杂交前若为双链，应先变性成单链，然后用偶联有酶或荧光物质的亲和素的探针与待测核酸的片段互补杂杂，使杂交部位显色（加入相应的酶底物）或产生荧光。灵敏度可达1～10pg水平，与放射性探针法相近。如果进一步改进，甚至可超过后者。
一、探针的类型
核酸分子探针是指用放射性核素或其他标记物标记的、能与特定的靶分子发生特异性相互作用的DNA或RNA片段。
1． 基因组DNA探针：病毒DNA等
2． cDNA探针；最常用
3． 寡核苷酸探针：10-50bp，测序、点突变
4． RNA探针：稳定性高、特异性强，但RNA极易降解，不宜操作。
二、探针的标记物
理想的标记物：敏感度高；特异性强；不影响探针分子的主要理化特性；标记、检测方法简单、探针保存时间长；对环境无污染、对人体无损害；价格低廉。
一）放射性标记物
二）非放射性标记物
（一） 放射性标记物——放射性核素
利用放射性核素能产生射线的特性将核素标记在核酸合成所必需的NTP或dNTP上，通过一定方法掺入到DNA 或RNA 中去制成探针，与待测的核酸杂交后，核素产生的？或？射线可使底片感光的特性，通过放射自显影的方法进行检测。
产生？射线的核素：32P、3H、35S
产生？射线的核素：125I
1、常用的放射性核素
1） 32P：产生？射线，灵敏度高，分辨率强，是最常用的放射性标记物，但半衰期短（14。3天）：？位和？位标记。
2）35S：分辨率高、半衰期长（87.1天）。敏感度底
2、放射性标记物的优缺点
优点：灵敏度高：0.01pg
特异性强
缺点：放射性污染
成本高、半衰期短，不能长期保存
二）非放射性标记物
1、优缺点
优点：无放射性污染，成本低、操作简单
缺点：敏感性、特异性均低于放射性核素
2、常用的标记物
1）生物素：1-2pg
生物素化核苷酸：bio-16-dUTP
bio-11-dUTP
生物素化核苷酸----通过酶触反应掺入到DNA中去制成探针----杂交----抗生物素蛋白-生物素-酶的复合物—加底物—显色
光敏生物素：生物素与光敏基团结合----光敏生物素-----光敏生物素与核酸探针混合----在强光的作用下----光敏基团与核酸共价结合---生物素标记的 探针
生物素化的核苷酸和光敏生物素
2）地高辛甙元
Dig-dUTP-----通过酶触反应掺入到DNA中去制成探针----杂交----加抗地高辛-酶的复合物—加底物—显色
灵敏度较高：0.1pg
特异性较生物素高
是较理想的非放射性标记物
三、探针的标记方法
（一）缺口翻译法或切口平移（nick translation）
缺口翻译法的原理
限量DNase I在待标记的双连DNA的每一条连上产生若干个单连缺口
利用E.coli DNA多聚酶I的5’-3’外切酶的活性和5‘-3’多聚酶的活性，在缺口处5’末端每切除一个核苷酸，则在3’末端添加一个核苷酸，以修补缺口。
随着缺口在5’末端的移动修饰的核苷酸就掺入到新合成的DNA连中
缺口翻译法的特点
1）快速、简便、标记的探针均一、特异性高
2）仅适用于较长的双连DNA
3）DNA多聚酶必须是E。Coli DNA多聚酶的全酶
4）DNA酶I的浓度一定要适宜
（二）随机引物法（random priming )
随机寡核苷酸引物（random primer)：含有各种可能排列顺序的寡核苷酸片段的混合物，可以与任意核苷酸序列杂交，起到聚合酶反应引物的作用
E。coli DNA聚合酶I的Klenow大片段（仅具有5-3多聚酶的活性，而无外切酶的活性）
随机引物法标记的原理
变性后的探针DNA或RNA与随机引物混合
随机引物按碱基互补的原则与模板DNA 的相应区域结合
DNA多聚酶I的Klenow大片段即从引物3’-OH端开始合成互补DNA连
反应中若加入修饰的dNTP即可获得标记的DNA探针
随机引物法的特点
1）不但可用于双连DNA的标记，而且可用于单连DNA和RNA的标记
2）操作简单
3）标记率高
(三）末端标记法
末端脱氧核苷酸转移酶法（terminal deoxynucleotide transferase)
5’——DNA——3’OH+？-32 p- dNTP
↓
5’——DNA——3’(pdN)n +nPPi (焦磷酸）
T4多核苷酸激酶法（method of T4 polynucleotide kinase)
T多核苷酸激酶法（method of T4 polynucleotide kinase)
（四）cDNA探针的标记
（五）RNA探针的标记
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