凡是需要做分子生物学实验的lab，肯定少不了一台核酸定量的机器。目前流行的仪器是分光光度计，只需滴加一两微升的样品，按一下按钮，利用核酸的紫外吸收特性，即可得到浓度数据。但在近几年，以Qubit为代表的基于特异荧光染料法的仪器逐渐被越来越多的科研人员采用。
那么，这两类仪器有什么区别，在使用时需要注意什么，如何根据实验需求来选购？
今天絮叨的小编就来帮大家具体分析一下 ：
分光光度计利用了核酸的紫外吸收特性。核酸，包括DNA和RNA，均由脱氧核糖或核糖、磷酸基及含氮碱基构成。其中，由于碱基含有芳香环结构，因此具有紫外吸收的特性。通过测定260nm处的吸光度，对DNA和RNA进行定量。与此同时，还能通过计算OD260/OD280估计核酸的纯度。由于此法不具有选择性，无法区分DNA、RNA或蛋白质。检测数值极易受到其他污染物(如游离核苷酸、盐和有机化合物)和碱基组成差异的影响。
而Qubit采用的是荧光染料法。这些荧光染料可以特异地与双链DNA、单链DNA、RNA或蛋白质相结合，并在特定波长光源的激发下，发出荧光，这一系统不会检测到样本中可能存在的其他杂质分子，荧光强度与样品中的靶分子浓度相对应。
现在了解了他们原理的不同
那就跟着我们看看在应用上的区别吧
DNA或RNA的选择性PK
由于原理上的差别，Qubit技术只报告靶分子(而不是杂质)的浓度，对目的分子具有极高的特异性，可以使您获得十分精确的结果；而采用紫外吸收法时，无法将它们DNA、RNA或游离核苷酸加以区分。研究人员曾经做过实验，在使用DNA和RNA含量相同的样本的情况下，利用Qubit dsDNA BR 分析试剂盒测定其中DNA的浓度，结果发现测量结果在实际含量的的±2%范围内，之后，他们使用了RNA含量比DNA高10倍的样本，发现测得的DNA浓度仅比实际值高7%，这足以证明Qubit的厉害。
再来看看分光光度计的表现吧。研究人员发现对于DNA:RNA不同浓度比例的样品， 紫外分光光度计结果偏差很大，它们无法准确测定上述样本中DNA和RNA的含量（图1）。好吧，这一回合Qubit 获胜。
图1.Qubit和紫外分光光度计对DNA-RNA混合样品的测定。标示的浓度是在Qubit分析管中稀释前起始样本的DNA和RNA浓度比。红色和橙色趋势线分别表示起始样本中DNA和RNA的实际含量。
低浓度下的准确性PK
研究人员之后采用Qubit dsDNA HS分析试剂盒及Qubit 荧光计，定量浓度仅为10 pg/μL的样本中的DNA，发现测得值在实际值的±12%范围内。而采用分光光度计测量上述相同样本，测得的浓度比实际值高46倍。而对于10 ng/μL的样本，Qubit 测得值在实际值的±1%范围内，而分光光度计测定的浓度在实际值的±5%范围内（图2）。显然，在样本浓度低的情况下，使用Qubit 更为合适。
图2. Qubit 和紫外分光光度计测定低浓度DNA时的偏差和重复差异比较。
样本浓度范围PK
Qubit 的配套试剂盒有很多种，分别适合dsDNA、ssDNA、RNA、microRNA和蛋白质，能够检测1-20 μL样本。其中，双链DNA分析试剂盒又分为高灵敏度（HS）和宽范围（BR）两种，适合10 pg/μL至1 μg/μL的DNA。与之类似，Qubit RNA HS和BR分析试剂盒覆盖的样本浓度范围在250 pg/μL至1 μg/μL。而分光光度计的检测范围通常在2 ng/μL至15 μg/μL（图3）。由此可见，Qubit 适合的浓度范围更宽，不过，高浓度样本在分光光度计上测定就不必稀释。
图3. Qubit分析与采用分光光度计进行紫外吸光度检测的样本浓度范围比较。
紫外分光光度计与荧光计各有优势
互相配合
当然，分光光度计也有它的优势。全光谱吸光度读数可以通过吸收峰显示是否有污染物存在，适用于会受到污染物危害的下游应用领域。另外，它的使用成本较低，上样、测定、擦拭即可，几乎不需要消耗品。Qubit 仪器更便宜，但需要购买配套的染料分析试剂盒。所以在分子实验室，我们建议您两种设备都可以配合使用。紫外分光光度计仪器可提供纯度及是否存在污染物等信息，Qubit具有特异性, 适合需要精确定量的下游实验或者低浓度的珍贵样品，比如二代测序，MicroArray，荧光定量PCR等。
如今，Qubit 已经升级到第三代，虽然没有之前那么萌，但易用程度再次升级。5.7英寸的彩色触摸屏方便设置和使用，更有多种操作语言供你灵活选择。全新的荧光计模式，使得您可以获得每个样本的原始荧光数据（RFU），配合MyQubit在线工具可以创建新的分析类型，不断扩展您的应用范围。Qubit 3 荧光定量仪采用强大的双核处理器，5秒内快速准确地定量DNA、RNA和蛋白。浓度计算和设置都由仪器自动完成。若样本浓度处于延伸范围或超出范围，屏幕上均会有图形显示。
测量工作也很简单，所有Qubit试剂盒均采用相同的操作方案，只是孵育和读数稍有差异。其中DNA和RNA分析试剂盒仅需孵育2分钟，而蛋白分析试剂盒需要15分钟。1-20 μL样本均可使用。Qubit最多可储存1000个样本结果，你也可以通过U盘导出，也可以使用USB连接线直接与电脑相连。
如今，赛默飞提供单台Qubit 荧光定量仪、起始套装（包括四种分析试剂盒）以及NGS起始套装，供您选择。如果您还没有下定决心购买，可以先申请试用，看看它的表现如何。
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