文/韩英
编辑/Bruce.Y
图片/网络+原创
核酸
鉴定
DNA
RNA
核
酸纯化在分子生物学实验室已经广泛应用。怎样获得高质量、高纯度的DNA或RNA样品对下游实验的顺利进行至关重要，因此，对纯化后的核酸进行鉴定也是必不可少的步骤。本文简单的回顾学习一下核酸鉴定的方法。
福际生物Direct PCR试剂盒不需要单独进行核酸纯化，直接将样本加入含有福际直接PCR体系的PCR管中上机反应即可！
核酸鉴定包括：
浓度/纯度鉴定+完整性鉴定
1.浓度/纯度鉴定
（1）紫外分光光度计：
原理：由于核酸中的碱基都具有共轭双键，所以具有紫外光吸收性质。核酸在紫外光谱区有一条典型的吸收曲线，其吸收高峰在260nm处，吸收低谷在230nm处。蛋白质在紫外区的吸收高峰在280nm处，所以核酸的紫外吸收光谱数据是鉴定核酸的重要依据之一。
由于核苷酸最大吸收波长为260nm,根据朗伯-比尔定律可计算出在波长260nm的紫外线下，1个OD值的光密度大约相当于50μg/ml的双链DNA， 40μg/ml的单链RNA。紫外分光光度法只适用于测定浓度大于0.25μg/ml的核酸溶液。
计算公式:
dsDNA（μg/μl）=OD260x50x稀释倍数/1000
RNA（μg/μl）=OD260x40x稀释倍数/1000
纯净的DNA OD260/OD280=1.8，制备的样品DNA比值在1.7-1.9，若洗脱时不使用洗脱缓冲液而使用去离子水，比值会偏低，因为PH值和离子存在会影响光的吸收值。
当OD260/OD280<>
当OD260/OD280> 2.0，表明RNA含量较高。可用RNaseA消化后再进行纯化。
OD260/OD230的值，一般不小于2.0，若小于2.0，表明有碳水化合物、盐类或有机试剂污染。
实例：基因组DNA提取得率和纯度
FOREGENE Soil DNA Isolation Kit( DE-05511)
特点：
简便—无需研磨、无需低温操作。
快速—90min内完成操作。
安全—无需有机试剂。
本试剂盒处理各种来源土壤样本，获得的基因组DNA量和纯度见下表：
纯净的RNA OD260/OD280=2.0，制备的样品DNA比值在1.8-2.1 ，OD260/OD280比值会受到所用溶液PH值的影响，例如，纯化的RNA在PH=7.5的缓冲液中OD260/OD280读数在1.9-2.1之间，而在中性的水溶液中比值会偏低，可能只有1.8-2.0，这并不意味着RNA的质量变差，所以还需要做电泳检测。
OD260/OD280<>
OD260/OD230的值，一般不小于2.0，若小于2.0，表明有胍盐，β-巯基乙醇或乙醇的残留,但是根据样品不同，比值可能有所变化，如下表中小鼠肾和脑组织提取出的RNA260/230比值偏小。
实例：组织RNA提取得率和纯度
FOREGENE Animal Total RNA Isolation Kit （RE-03012）
特点：
简便—无需低温操作。
快速—30min内完成操作。
安全—无需有机试剂。
本试剂盒处理各种小鼠组织样本，获得的RNA量和纯度见下表：
（2）荧光光度法：
荧光光度法以核酸染料溴化乙锭EB嵌入碱基平面后，使本身无荧光的核酸在紫外线激发下发出橙色荧光，且荧光强度积分与核酸含量成正比。该方法灵敏度可达到1-5ng，适合低浓度核酸溶液的定量分析。另外，SYBR Gold作为一种新的超灵敏的荧光燃料，可以从琼脂糖凝胶中检测出低于20pg的双链DNA。
用溴化乙锭等荧光染料示踪的核酸电泳结果可判定核酸的纯度。由于DNA分子较RNA大许多，电泳迁移率低；RNA中rRNA最多，占80-85%,tRNA及核内小分子RNA占15%-20%，mRNA占1%-5%。RNA电泳后可呈现特征性的三条带。在原核生物为明显可见23S、16S的rRNA条带及由5S的rRNA与tRNA组成的条带。真核生物为28S 、18S 的rRNA及由5S、 5.8S的rRNA和tRNA组成的条带。mRNA因量少且分子大小不一，一般是看不到的。通过电泳分析我们可以鉴定在RNA制品中有无DNA污染，亦可鉴定在DNA制品中有无RNA污染。
TIP
实验室中常用的超微量紫外分光光度计取样量少，因此误差相对较大，而且比色皿清洗不干净会存留污染物，可能导致吸收值出现严重偏差。
So，紫外分光光度计比值不能作为核酸纯度鉴定的唯一判定标准，使用紫外分光光度计法与凝胶电泳法相结合才能更准确的判定核酸的质量。
2.完整性检测
常规使用琼脂糖凝胶电泳法，基因组DNA的分子量很大，在电场中泳动很慢，如果有降解的小分子DNA片段，在电泳图上可以显著的表现出来。
完整的无降解或者降解很少的RNA电泳图，除具有特征性的三条带外，一般28S (或23S)RNA的荧光强度约为18S（或16S）RNA的2倍，否则提示有RNA的降解（图1）。
RNA样本电泳可能出现明显的三条以上的条带（图2），请不用担心，因为细胞中有些细胞器也含有RNA，如线粒体、叶绿体。如果电泳上样孔附近有着色条带，则说明有DNA污染。
必要时，还可以通过一些特殊的实验分析RNA的完整性，如小规模的第一链cDNA合成反应。
福际生物针对不同的样本类型开发了相应的核酸纯化试剂盒。
FOREGENE特有的过滤柱可直接将DNA和RNA分离，无需添加相应的核酸酶，即可获取高质量的核酸！方便快捷，物美价廉！
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