1.Sanger
2.454
3.Solid
4.HiSeq2000
5.Helicos
6.DNA Nanoball array
7.The PacBio RS system
8.PGM
9.MiSeq
企业:Life Technology
推出时间:1977年发明,1986年第一台商业化测序仪
主流型号:3730XL
样品要求:PCR产物:浓度≥50ng/ul 体积≥10ul;质粒:含量≥5ug;菌液:体积≥1ml。
测序原理:
双脱氧链终止法:Sanger法测序的原理就是,每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)使之扩增,并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)使之终止。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3‘-OH基团,使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止,终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整,使反应得到一组长几个至千以上个,相差一个碱基一系列片断。它们具有共同的起始点,但终止在不同的的核苷酸上,可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段,凝胶处理后可用X-光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测。
文库制备:无需建库,提供质粒、菌液、PCR产物等均可以
模板制备:PCR扩增
读长:500-1000bp
测序通量:
四种测序方式的每天通量:
短片段测序36cm36min500bp 1,728,000bp/day;
快速测序36cm60min700bp 1,440,000bp/day;
标准测序36cm90min800bp 1,113,000bp/day;
长片段测序50cm120min1100bp 1,002,000bp/day。
(36cm指毛细管长度,36min指一次反应时间,500bp指一个反应的读长;)
时间/run:36 min-2 hours
碱基精确度:99.999%
变异检测能力(DNA重测序方面):
heterozygous insertions and deletions,microsatellite, SNP, AFLP, T-RFLP,and LOH analyses
AFLP:扩增片段长度多态性(Amplified Fragment Length Polymorphism),;
T-RFLP:限制性片段长度多态性(terminal restriction fragment length polymorphism);
LOH analyses:杂合性缺失(Loss of Heterozygosity);
成本:$95,000 per machine, about $4 per reaction, 800bp per reaction,
数据格式:*.bcf ; *.abl
分析软件:
数据收集软件Data Collection v2.0 (随机提供)
Manages your instrument setup, controls instrument operations, allows real-time data visualization, and performs diagnostics. New features include:
- Auto-analysis with GeneMapper® v3.5 and SeqScape® v2.1
- FDA 21CFRpart 11 compliance (for US customers)
- Flexibility to use any choice in dye set option
- Additional optimized sequencing run modules covering more applications
序列分析软件Sequencing Analysis v5.1
Designed to base-call; assign quality values; trim, display, edit and print DNA sequencing data using the KB basecaller
序列拼接和比较基因分析软件Seqscape® v2.1
Provides everything you need to perform resequencing applications such as VariantSEQr? Resequencing System
自动化基因片段分析软件GeneMapper® v3.5
Enables configurable, automated allele calling -- a plus for high-throughput genotyping and includes tools for SNPlex? data analysis
SNP分型数据管理软件BioTrekker? v1.0 (optional data-mining tool)
Provides a fast, powerful way to search for, retrieve, and manage millions of genotypes
优点:测序金标准,读长长
缺点:通量低,成本高
经典案例:Sanger测序属于测序技术的金标准,文章众多
备注:鉴于测序本身方法的局限,测序引物后10bp~40bp无法保证准确
企业: Roche
推出时间: 2005年
主流型号: Genome Sequencer FLX Titanium(2008年推出)
样品要求: 5 μg of DNA,浓度≥300 ng/μL
测序原理:焦磷酸测序
在测序时,使用了一种叫做“Pico TiterPlate”(PTP)的平板,它含有160多万个由光纤组成的孔,孔中载有化学发光反应所需的各种酶和底物。测序开始时,放置在四个单独的试剂瓶里的四种碱基,依照T、A、C、G的顺序依次循环进入PTP板,每次只进入一个碱基。如果发生碱基配对,就会释放一个焦磷酸。这个焦磷酸在各种酶的作用下,经过一个合成反应和一个化学发光反应,最终将荧光素氧化成氧化荧光素,同时释放出光信号。此反应释放出的光信号实时被仪器配置的高灵敏度CCD捕获到。有一个碱基和测序模板进行配对,就会捕获到一分子的光信号;由此一一对应,就可以准确、快速地确定待测模板的碱基序列。
文库制备:Fragment(300-800 bp), Mate-pair
模板制备:微乳液PCR
读长:400bp
测序通量:0.4-0.6 Gb/run
时间/run:10 hours
碱基精确度:Q20读长为400个碱基
变异检测能力(DNA重测序方面:SNP, Indel, SV, CNV
成本:仪器$500,000/台,测序$5,600 per whole plate
数据格式:Raw data:SFF格式
分析软件:GS De Novo Assembler软件;GS Reference Mapper软件;GS Amplicon Variant Analyzer软件
优点:突出优势是读长长,使得后继的序列拼接工作更加高效、准确。速度快,一个测序反应耗时10个小时,获得4-6亿个碱基对。
缺点:无法准确测量同聚物的长度,所以检测插入缺失突变的误差率高;通量小且费用高。
经典案例:1.Complete Khoisan and Bantu genomes from southern Africa.Schuster SC et al. (2010) Nature 463(7283): 943-7.
(更多详见https://www.roche-applied-science.com/sis/sequencing/genome/index.jsp)
备注:特别适合从头拼接和宏基因组学应用,多用于新的细菌基因组。对重测序来说太贵,不适合
企业: Life Technology(2008年,ABI与Invitrogen合并为Life Technology公司)
推出时间: 2007年
主流型号: Solid?4.0(2010年推出)
样品要求:
? Fragment文库10 ng-5 μg
?Paired-end文库10 ng-5 μg
?Mate-paired文库5 μg-20 μg
测序原理: 边连接边测序
测序引物与接头可以互补杂交,其5‘端可与和邻近序列互补的寡核苷酸相连。八聚体寡核苷酸可竞争性与引物相连接(该寡聚体的第四位和第五位为荧光标记位点)。当其标记颜色被读取后,即将连接上的寡核苷酸在第五位和第六位之间切断,以移除标记,进行下一轮反应,以此依次循环。在第一轮反应中,可以得到确定的碱基位点为:4、5、9、10、14、15位碱基等。重复该反应过程,偏移一位碱基,使用较第一轮少一个碱基的引物进行反应,可以确定的碱基位点包括:3、4、8、9、13、14等,如此往复,直至偏移至引物的第一个碱基(即待测序列0位点碱基)。由于该位点碱基已知,可通过读取的荧光颜色得知位点1的碱基类型,然后,又以位点1碱基荧光颜色推知位点2的碱基类型,依此类推,直至整个序列读序完成。
文库制备:
? Mate-paired 文库 (插入片段 600 bp to 10 Kb)
? Paired-end 文库
? Fragment 文库
模板制备: 微乳液PCR
读长:2*50 bp
测序通量: 100-120 Gb/run, 12G/day
时间/run: 7~12 days
碱基精确度: 原始碱基数据的准确度大于99.94%,而在15X覆盖深度时的准确度可以达到99.999%
变异检测能力(DNA重测序方面): SNP, Indel, SV, CNV
成本: 仪器$495,000/台,测序$6000/100Gb
数据格式: Raw data: *csfasta和*quel;比对输出格式:BAM/SAM。
分析软件: 分析软件:Bioscope,比对后格式有很多第三方软件支持
优点: 高准确性,每个DNA碱基检测2次,增加了序列读取的准确性
缺点: 运行时间长,检测碱基替换突变的误差率高
经典案例: SOLiD测序技术仅在DNA应用发表的文章共60篇,包括发表在Science/Nature及其子刊上的高水平文章15篇,其中de nove sequencing文章3篇,targeted resequencing文章26篇,whole genome resequencing文章31篇。SOLID在RNA和表观等文章应用也同样广泛。
备注: 行业领先的准确性实现了重要的生物变异检测,适合全基因组重测序、定向重测序和全转录组分析等应用。
企业: Illumina
推出时间: 2010/1/1
主流型号: Illumina HiSeq2000
样品要求: 6ug/sample,无RNA、蛋白污染,无降解,OD260/OD280=1.8-2.0
测序原理: 边合成边测序
这种测序技术通过将基因组DNA的随机片断附着到光学透明的表面,这些DNA片断通过延长和桥梁扩增,形成了具有数以亿计cluster的Flowcell,每个cluster具有约1000拷贝的相同DNA模板,然后用4种末端被封闭的不同荧光标记的碱基进行边合成边测序。这种新方法确保了高精确度和真实的一个碱基接一个碱基的测序,排除了序列方面的特殊错误,能够测序同聚物和重复序列。This technology attach random fragment of genome DNA to optically transparent surface.And by extention bridge amplification of the DNA fragments,it create a flow cell with > 10 million clusters, each containing ~1,000 copies of same template. Then sequence by synthese using four kind of terminal-closed base with different fluorescent mark. This technology assures the high accuracy and one by one base sequencing, avoids special mistakes of sequence and can be applied for repeated sequence and homopolymer.
文库制备: Fragment, Mate-pair (200bp-40kb)
模板制备: 桥式扩增
读长: 50SE,91PE,101PE 等
测序通量: 25G/day
时间/run:
91/101PE, 8-10 days ;
50SE, 3 days;
150PE, 15 days;
总体来说,策略不同,时间也有差别
碱基精确度: Q30%≥80%;Q20%≥90%
变异检测能力(DNA重测序方面): SNP、Indel、SV、CNV
成本: $690,000 per machine , $6000 per human genome sequencing(30X)
数据格式: 测序结果:*.fq;比对:*。SOAP/*.BAM/*.SAM;变异:*.gff
分析软件: GenomeStudio或者第三方软件包;自主选择
优点: 通量大,测序方式灵活,分析软件多样化
缺点: 在成本上目前高于第三代测序,样本制备过程复杂,样本要求相对 较高。
经典案例: Initial genome sequencing and analysis of multiple myeloma.Chapman MA,et al.Nature. 2011 Mar 24;471(7339):467-72.
Cytoplasmic intron sequence-retaining transc ripts can be dendritically targeted via ID element retrotransposons.Buckley PT,et al.Neuron. 2011 Mar 10;69(5):877-84.
Identification of fusion genes in breast cancer by paired-end RNA-sequencing.Edgren H,et al. Genome Biol. 2011 Jan 19;12(1):R6.
Genome-wide association mapping to candidate polymorphism resolution in the unsequenced barley genome.Cockram J,et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 2010 Dec 14;107(50):21611-6. Epub 2010 Nov 29.
MHC class II transactivator CIITA is a recurrent gene fusion partner in lymphoid cancers.Steidl C, et al.Nature. 2011 Mar 17;471(7338):377-81. Epub 2011 Mar 2.
Tumour evolution inferred by single-cell sequencing.Navin N,et al.Nature. 2011 Apr 7;472(7341):90-4. Epub 2011 Mar 13.
备注: 是目前市场上最主流的测序仪器,demo case众多;另外,The additional benefit is experimental flexibility- applications that require different read lengths can be run on each flowcell – an example is that a whole genome sequencing and de novo sequencing study (eg. Of human and microorganism) could be run on one flowcell at 2 x 100bp reads, and the other could be running ChIP-seq and gene ex pression samples at 1 x 50bp read length. Each flowcell is controlled independently; hence, a run can be started/stopped independent of the other.
企业: Helicos Biosciences
推出时间: 2008年
主流型号: HeliScope? Single Molecule Sequencer(2008年推出)
样品要求: 1-3 μg,起始DNA体积不超过100 μL.
测序原理: 边合成边测序,可逆阻断测序
待测DNA被随机打断成小片段,在每个小片段(~200 bp)的末端加上poly-dA,并于玻璃芯片上随机固定多个poly-dT引物,其末端皆带有荧光标记,以利于精确定位。首先,将小片段DNA模板与检测芯片上的poly-dT引物进行杂交并精确定位,然后逐一加入荧光标记的末端终止子。这个终止子与Illumina的终止子可不一样,不是四色的,是单色的,也就是说所有终止子都标有同一种染料。在掺入了单个荧光标记的核苷酸后,洗涤,单色成像,之后切开荧光染料和抑制基团,洗涤,加帽,允许下一个核苷酸的掺入。通过掺入、检测和切除的反复循环,即可实时读取大量序列。最后以软件系统辅助,可分析出完整的核酸序列。
文库制备: Fragment, Mate-pair
模板制备: 单分子检测
读长: 25-55 bp,平均35 bp
测序通量: 21 to 35 Gb/run
时间/run: 8 days
碱基精确度: >20X覆盖度时一致性超过99.995%
变异检测能力(DNA重测序方面): SNP, CNV
成本: 仪器$999,000/台,测序$0.45-0.60/Megabase.
数据格式: Raw data:srf或者sms格式
分析软件: 推荐用Helisphere开放资源软件进行过滤比对
优点: 真正的单分子测序,无需前期扩增,不引入偏向性;特别适合RNA-Seq或RNA直接测序的应用,因为它能直接测序RNA模板,而无需将其转化成cDNA。检测碱基替换突变的误差率非常低,~0.2%。
缺点: 错误率高,Insertion 1.5%,Deletion 3.0%;Heliscope在面对同聚物时也会遇到一些困难,但可以通过二次测序提高准确度;由于在合成中可能掺有未标记的碱基,因此其最主要的错误来源是缺失。
经典案例: 1.Single-molecule sequencing of an individual human genome.
Dmitry Pushkarev,Norma F Neff & Stephen R Quake.Nat Biotechnol, 27. (9): 847-852.
(更多详见http://www.helicosbio.com/HeliSphereCenter/PublicationsLibrary/HelicosScientificPublications/tabid/169/Default.aspx)
备注: 特别适合RNA-Seq或RNA直接测序的应用
企业: Pacific Biosciences
推出时间: 2009年底Science论文发表,2010年推出
主流型号: DNA Nanoball array
样品要求: DNA 由
PicoGreen定量:推荐10ug,最少7.5ug。浓度:75-150ng/ul;体积:50-200ul;DNA长度:大分子量双链基因组DNA,大部分超过20kb.
测序原理: 边连接边测序
采用了高密度DNA(玻璃板)纳米芯片技术和非连续、非连锁联合探针锚定连接(cPAL)技术来进行测序。基因组随机打断成500bp随机长度的片段,两端接上接头,成环,限制性内切酶酶切,重复2次,最终连接成一个DNA环,现阶段4接头建库方法能够支持70bp单端测序(35bp双端测序)。接着,所示,每个DNA环在反应液中高速扩增,形成一个纳米球(DNB),这样每一个DNA环大约扩增了200次。然后把这些纳米球平铺到预先处理过的玻璃板上,形成纳米芯片。最后通过非连锁联合探针锚定连接(cPAL)技术进行测序,10bp长的探针上有一个锚定碱基(A or T or G or C),其他位置都是N,通过与模板的杂交连接反应,根据4种不同的碱基(A/T/G/C)会有四种不同的荧光信号,总共需要40种不同的锚定探针。每一种锚定探针杂交之后都会进行洗脱。通过DNB芯片的荧光显影结果及解码分析,我们可以确定每个DNB的核酸序列。
文库制备: 500bp
模板制备: 纳米球(DNB)
读长: 35PE
测序通量: 20-60G/run/flow slide,共18 个flow slide
时间/run: 9 days
碱基精确度: 99.999%
变异检测能力(DNA重测序方面): SNP、Indel、SV、CNV
成本: 只提供测序服务,不出售仪器。09年11月的WGS成本为$1726 (45×),$8005 (87×)
数据格式: 基础文本格式,*.tsv。可交付结果包括:序列变异、功能注释、数据总结报告 及一整套上述结果的支持数据。
数据由三部分组成,主要部分是reads和mappings,其次是assambly 和variations,summary report最少
分析软件: Genome comparison tools
Format conversion tools
Annotation tools
Reference tools
,在开发中的还有用于癌症基因组分析的肿瘤-正常样本比对工具和用于家族基因组分析的工具,还有大规模比对工具可以同时比对数百个基因组。Complete Genomics Assembly Pipeline version 1.5.0
优点: 测序自动化,成本低,通量大
缺点: 读长短,分析软件不公开,样品要求高
经典案例: Identification by whole-genome resequencing of gene defect responsible for severe hypercholesterolemia. Jonathan Rios, et al. Human Molecular Genetics, Volume19, Issue22 Pp. 4313-4318.
Human Genome Sequencing Using Unchained Base Reads on Self-Assembling DNA Nanoarrays.Radoje Drmanac1,et al. Science, Vol. 327 no. 5961 pp. 78-81 .
Analysis of Genetic Inheritance in a Family Quartet by Whole-Genome Sequencing. Jared C. Roach,et al. Science, Vol. 328 no. 5978 pp. 636-639
The mutation spectrum revealed by paired genome sequences from a lung cancer patient.William Lee,et al.Nature ,Volume:465, Pages: 473–477
备注: mapping reads:40X/genome
企业: Pacific Biosciences
推出时间: 2010年2月开始早期试用
主流型号: PacBio RS
样品要求: 1kb以下500ng,纯化的基因组 DNA, BACs, cDNA 文库 或PCR 产物
测序原理: 边合成边测序,single molecule, real-time, or SMRT?, technology
这项技术的核心在于使用了Zero-Mode Waveguide(ZMW)(零波段边界)。测序的平台上有几万个小井,单个DNA聚合酶和要测序的DNA链固定在每一个小井里。带有荧光标记的脱氧核苷酸(A,T,C,G)被加入到每个小井里。每一种脱氧核苷酸在激化后分别能放出不同波长的荧光。小井的底部开了一个非常小的孔,小到比探测激光的单个波长还要短。根据我们的常识,这个孔太小了,激光无法从井的底部穿过去,从而无法激发脱氧核苷酸上的荧光物质。应此,底部的显微镜检测到的是一片黑暗。但是我们知道光线是一种波,它会衍射,激光虽然不能完全穿过小孔照亮整个小井,但它能透过小孔而勉强照亮小孔附近很小的一个区域。而DNA聚合酶正好被固定在这个小区域。当有单个脱氧核苷酸加载在DNA聚合酶上形成新的化学键时,这个脱氧核苷酸上的荧光物质被激活而发光,从而被显微镜观测到。这种特定颜色的荧光只持续一小段时间,应为这个碱基在DNA链上合成之后,它的荧光基团就会被剪切掉,从而继续下一个碱基的合成。当DNA链合成结束之时也是DNA链测序完成之时。但DNA聚合酶的活性会在激光照射下逐渐减弱,不能无限长度的进行合成反应,因此DNA链的测序长度也是有限的。
文库制备: Fragment, Mate-pair (250bp-6kb)
模板制备: SMRTbell? library, 无需常规扩增,1kb以下的文库只需要500ng样品
读长: 1000bp
测序通量: 高灵活性的测序通量
时间/run: 模板制备到 primary basecall analysis只需不到一天,一般只需要不到4个小时.
碱基精确度: 准确率社会评价不高,2011年1月发表的NEJM杂志(关于海地霍乱的测序)在其supplementary提到它的单碱基准确率只有81-83%。
关于其准确率的社会评价不好,有网站称其准确度很差,单次测序平均错误率15%,循环测序后降至8%
变异检测能力(DNA重测序方面): SNP、Indel、SV、CNV,可以直接进行甲基化等修饰测序,方便表观研究
成本: $700,000 per machine,$99 per SMRTTMCell, each patterned with 15,000ZMW, each ZMW contain a single DNA polymerase.
数据格式: bas.h5 – Base File and Filtered Bases File - Documentation
cmp.h5 – Reference Mapped File and Consensus File - Documentation
分析软件: mapping:BLASR (Basic Linear Alignment with Successive Refinement);组装:ALLORA (A Long Read Assembler);SNP 和Indel : RCCS (Reference Circular Consensus Sequencing) 客户端软件:SMRT Portal;提供:experiment specific, data-rich reports in industry-standard output formats containing both primary and secondary analysis data。可以使用第三方软件。
优点: 读长长;无需PCR扩增,也避免了由此带来的bias;需要的样品量很少;样品制备时间花费少;用RS系统可以远程快速获取数据和选择测序参数;通量灵活;时间快
缺点: 准确性低,需要循环测序,
经典案例: The Origin of the Haitian Cholera Outbreak StrainChen-Shan Chin,et al.N Engl J Med 2011; 364:33-42January 6, 2011.
Real-Time DNA Sequencing from Single Polymerase Molecules.John Eid, et al.Science 2 January 2009:
Vol. 323 no. 5910 pp. 133-138
DOI: 10.1126/science.1162986
备注: 1.在样品制备好后,有一个run design的步骤,可以在客户电脑上用RS remote 软件来自主选择运行方式和后续的个性化分析服务,以及第一时间接受测序数据2.截止2011年5月份已正式发售了多台RS测序仪,其中包括美国国家生化防卫分析与对策中心(NBACC)和冷泉港实验室。
企业: Ion Torrent
推出时间: 2010年
主流型号: Ion Personal Genome Machine?(2010年)
样品要求: 5 µg DNA,起始DNA体积不超过130µL
测序原理: 半导体芯片测序
该测序仪使用了一种高密度半导体小孔芯片。该芯片置于一个离子敏感层和离子感受器之上,每当有核苷酸分子被掺入时就会释放出质子,而离子感受器就会感受到这种信号,知道是哪一个核苷酸被掺入,从而读出DNA序列。
文库制备: Fragment(185–210 bp)
模板制备: PCR扩增
读长:
314芯片,100 bp;
316芯片,100bp;
318芯片,200 bp。
测序通量:
314芯片,10 Mb/run;
316芯片,100 Mb/run;
318芯片,1Gb/run。
时间/run: 2 hours
碱基精确度: 一致性超过99.99%,>99.5% raw accuracy.
变异检测能力(DNA重测序方面): SNP, Indel
成本: 仪器$50,000 /台,测序$500/run
数据格式: 标准的SFF或者FASTAQ格式
分析软件: 一系列商业软件进行变异检测,denovo组装
优点: 无以伦比的快速,2个小时完成测序工作;Ion Torrent的化学测序原理自然简单,无修饰的核苷酸、无激光器或光学检测设备,因而可达到极小的测序偏差和出色的测序覆盖均衡度。
缺点: 测序通量目前还不够大,增加半导体芯片的容量将有望提高测序仪的处理能力。
经典案例: 1德国大肠杆菌疫情爆发之后,华大基因利用第三代测序仪——Ion Torrent进行了该大肠杆菌的全基因组测序。在获得病毒样本后三天的时间内,华大基因完成了对该新型大肠杆菌的基因组测序。经过初步信息分析,发现该菌株是一种新的兼具侵袭、产毒、肠出血等特征的大肠杆菌。
备注: 特别适合微生物基因组测序及扩增子重测序
企业: Illumina
推出时间: 2011年
主流型号: MiSeq Personal Sequencing System(2011年)
样品要求: 使用Nextera,50 ng DNA;使用TruSeq,100 ng–1 µg DNA
测序原理: 边合成边测序
这种测序技术通过将基因组DNA的随机片断附着到光学透明的表面,这些DNA片断通过延长和桥梁扩增,形成了具有数以亿计cluster的Flowcell,每个cluster具有约1000拷贝的相同DNA模板,然后用4种末端被封闭的不同荧光标记的碱基进行边合成边测序。这种新方法确保了高精确度和真实的一个碱基接一个碱基的测序,排除了序列方面的特殊错误,能够测序同聚物和重复序列。
文库制备: Fragment
模板制备: 桥式扩增
读长:
1*35 bp
2*100 bp
2*150 bp
测序通量:
1*35 bp >120 Mb/run
2*100 bp >680 Mb/run
2*150 bp >1 Gb/run
时间/run:
扩增测序总时间:
1*35 bp 4 hours
2*100 bp 19 hours
2*150 bp 27 hours
碱基精确度:
>90% bases higher than Q30 at 1*35 bp
>80% bases higher than Q30 at 2*100 bp
>75% bases higher than Q30 at 2*150 bp
变异检测能力(DNA重测序方面):
成本: N/A
数据格式: 仪器$125,000/台,测序$750/run
分析软件: *.bcl, FASTQ, BAM, *.vcf和*.csv.
优点: 样品制备简单快速,在一台仪器上完成测序和数据处理;可靠的化学方法,可逆中止碱基边测序边合成法
缺点: N/A
经典案例: N/A
备注: 特别适合扩增子测序、克隆检查和小基因组测序。
来源:生物文摘
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