近日，美吉生物合作客户河南师范大学姜继韶课题组在“Bioresource Technology ”上发表了一篇题为“Exploring the mechanisms of organic matter degradation and methane emission during sewage sludge composting with added vesuvianite: Insights into the prediction of microbial metabolic function and enzymatic activity”的文章。该文章通过16S测序和qPCR方法，研究了污泥堆肥过程中添加符山石对有机质降解和甲烷排放的影响机制。下面小编就带大家一起看下这篇文章的精彩内容！
文章简介
中文题目：探究添加符山石的污水污泥堆肥过程中有机物代谢和甲烷排放的机制：预测微生物的代谢功能和酶活性
发表杂志：Bioresource Technology
影响因子：5.7
研究背景
堆肥是将有机废弃物转化为腐殖质的一种有效途径，可作为肥料和土壤调节剂。但堆肥过程中由于氧气分布不均，会造成CO2和CH4等温室气体的产生。符山石（V）是一种有较高总孔容和吸附容量的膨胀剂，一般认为在堆肥过程中添加V能加速有机物的降解，降低CH4的排放，但至今还没有具体应用的相关报道。
因此，为了探究V对于有机物降解和甲烷排放的影响，本文通过q-PCR定量测定细菌和甲烷氧化菌的丰度，同时利用高通量测序技术研究污水污泥（SS）堆肥过程中添加V后细菌和甲烷氧化菌群落的演变。使用PICRUSt预测堆肥高温处理阶段的细菌代谢功能，此外还研究了甲烷氧化群落与理化指标间的相关性。
实验设计
研究结果
1、理化指标检测
表1 堆制过程中温度、水汽、C/N比和NH4-N的变化
注：根据温度分布设置不同温度等级，升温期（>50℃）；降温期（30-50℃）；后熟期（<30℃）。CK-不添加符山石对照组，V-添加15%符山石。
图1 污水污泥堆肥过程中OM含量(a)、CO2排放量(b)、CH4排放量(c)、CO2/CH4(d)变化
在堆肥过程中，微生物将OM作为能量来源，其含量逐渐降低，堆肥完成后在对照组和处理组中分别下降40.0%和49.3%（图1a）。堆肥第三天CO2排放量达到最大，随后逐渐下降，处理组CO2累积排放量为193g，相比于对照组高34.0%（图1b）。
无氧环境有利于CH4的产生，在0-4天由于微生物对氧气的消耗，CH4排放量增加，在第4天达到最大值。在整个堆肥过程中，处理组相较于对照组CH4排放量低33.6%（图1c）。在整个处理过程中特别是在降温阶段，处理组CO2/CH4的比值远远高于对照组（图1d），其原因可能是对照组堆肥塌陷，阻止了O2的扩散，而V能降低容重并增加氧气吸收率，不利于CH4的生成。
2、细菌总数和产甲烷菌的q-PCR定量分析
图2 污水污泥堆肥过程中TB(e)和mcrA(f)的丰度变化
对总细菌（TB）和产甲烷菌（mcrA）的基因丰度进行q-PCR定量分析，结果表明处理组和对照组的TB丰度均在第四天达到最大值，相比于实验初期分别增加了1.8和4.9倍，随后快速降低，但由于V的添加为微生物提供了无机养分和合适的生长环境，因此处理组TB的丰度相比于对照组显著增加了1.7-2.7倍（图2e）。
两组处理mcrA丰度均在前四天快速升高，随后逐渐下降。CH4的排放与mcrA基因丰度的变化趋势一致，相较于对照组V的添加会显著降低mcrA基因的丰度（图2f）。也就是说，在对照组中OM在高温期降解过程中不仅要消耗大量O2，还会抑制O2的扩散，从而营造了适合产甲烷菌生长的厌氧环境。而V的添加能作为一种有效的支架，显著减缓厌氧条件的形成，大大降低了产甲烷菌生长的适宜性。
3、细菌和产甲烷菌落的演替
门水平上，处理组和对照组均有四个主要的细菌物种，Firmicutes为主要的优势菌群。在高温阶段，处理组与纤维素、半纤维素和木质素的分解有关的三个优势菌门(Proteobacteria, Actinobacteria, Bacteroidetes)相对丰度高于对照组，这也验证了V能加速OM的降解速率和CO2的排放。在属水平，共发现27个丰度≧1%的物种，优势属包括Bacillus，Ureibacillus, Oceanobacillus，Candidatus_Microthrix，Sphingobacterium，Hyphomicrobium等（图3b）。
产甲烷菌在门水平发现Euryarchaeota的相对丰度为98.0-99.3%，处理组在门水平上没有显著影响（图2c）。在属水平，处理组和对照组丰度top15的产甲烷菌属（相对丰度> 0.01％）在高温和后熟阶段略有差异（图3d）。
图3 堆肥过程中细菌和产甲烷菌群的基本信息a细菌群落门水平的物种组成；b细菌群落属水平的物种组成；c产甲烷菌群门水平的物种组成；d产甲烷菌群属水平的物种组成
对丰度top10的属进行物种差异分析，结果发现在高温阶段期间，V组仅比CK组多三个属（unclassified_f_Methanobacteriaceae, unclassified_o_Methanomicrobials, unclassified_o_Methanobacteriales）。在后熟阶段，只有unclassified_f_Methanobacteriaceae，Methanosphaera和Methanoculleus的相对丰度显著高于CK。说明添加V可显著降低大部分产甲烷菌的相对丰度，从而减少堆肥过程中CH4的排放。
图4 属水平相对丰度统计比较。a对升温阶段CK1和V1组丰度前10的属的比较；b对后熟阶段CK2和V2组丰度前10的属的比较
4、利用PICRUSt探究有机物降解和CH4排放机制
图5 PICRUSt分析污水污泥堆肥过程中细菌功能的差异。a COG功能聚类；b生化代谢途径；c代谢。
利用PICRUSt软件，对升温阶段的两组样本进行功能预测，如图5a所示，共注释到18个代谢相关的功能，其中能量产生和转化、氨基酸转运和代谢、转录以及其它未知功能相对丰度较高，此外V1处理中18个功能特征的丰度总是高于CK1组，表明V能增强微生物的活性和功能，进而增加有机物降解速率和CO2的产生。
如图4b所示，KEGG通路分析可分为六个组，其中59.2%的蛋白属于代谢，18.3%属遗传信息处理，16.4%属于环境信息处理，4.2%属于细胞过程，1.0%属于人类疾病和0.8%属于有机体系统。参与代谢组的有13个通路，其中二氧化碳代谢和氨基酸代谢通路的丰度高于其余11个通路。图4b/c表明V能在6个组25个通路中增加蛋白丰度，从而加强细菌的代谢和有机物的降解。
图6 PICRUSt对酶的丰度进行预测。a与OM代谢相关酶的丰度；b与CH4产生和氧化相关酶的丰度
KEGG通路分析表明除寡聚-1,6-葡糖苷酶以外，其余与纤维素、半纤维素降解有关的五种酶在V1组中的含量均高于CK1组（图6a）。由此表明处理组含量较高的酶能快速降解OM，为微生物的代谢提供更多可利用的物质。F420辅酶是CH4形成过程中的关键辅酶，图6b表明与甲烷产生有关的两个F420辅酶在V1组中含量低于CK1组，但V1组内三种甲烷氧化酶含量高于CK1组。因此处理组中甲烷生成的酶含量低，甲烷氧化酶含量高会降低甲烷的排放。
5、环境因子与产甲烷菌群的关联
Heatmap图展示丰度前30的产甲烷菌属与5种环境因子的相关性，结果表明温度和NH4-N只与unclassified_o_Methanomicrobiales显著相关（P<0.001），MC、OM和C/N 均与unclassified_o_Methanobacteriales,unclassified_f_Methanosarcinaceae,Methanosarcina,Methanosaeta,Methanomethylovorans, Methanolinea和Methanobacterium显著相关（P<0.001），表明MC和C/N是影响产甲烷菌结构组成的主要因子，能显著影响产甲烷菌群和CH4的排放，因此优化堆肥中的MC和C/N能有效降低CH4的排放。
图7 属水平丰度前30的物种与环境因子的相关性heatmap图
研究结论
1. 相比于对照组，添加V能使有机物的降解速率提高9.3%，CH4排放量降低33.6%。
2. 在属水平上，V能显著降低mcrA基因丰度和产甲烷菌群落丰富度。
3. PICRUSt表明V增强了OM降解相关酶的活性，降低了CH4产生有关辅酶的活性。
4. MC和C/N是显著影响产甲烷菌群的环境因子，由此表明在污水污泥堆肥过程中符山石是能加速OM降解，降低CH4排放的有效添加剂。
小编评语：本文采用高通量测序和qPCR定量分析，同时使用美吉生物云进行分析呈图。美吉生物提供微生物多样性测序与qPCR定量验证一站式服务，实验设计更完整，paper发表更轻松！
【参考文献】
Jiang J, Wang Y, Liu J, et al. Exploring the mechanisms of organic matter degradation and methane emission during sewage sludge composting with added vesuvianite: Insights into the prediction of microbial metabolic function and enzymatic activity[J]. Bioresource technology, 2019, 286: 121397.
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