构树叶总黄酮对肝癌HepG

　　研究内容和目的 1采用微波辅助提取法从构树紧中提取构树叶总黄酮,经大孔树脂柱、聚酰胺柱进行分离纯化,做初步鉴定。 2体外观察构树叶总黄酮抑制肝癌细胞株HepG-2细胞生长的作用,明确量效关系,选择药物的半数抑制浓度为后期进行构树叶总黄酮抗肝癌机制研究做参考。 3为开发利用构树叶资源提供科学的实验依据。 研究方法 1采用微波辅助提取法,提取构树叶总黄酮初品,将提取物进一步进行分离鉴定。 2应用噻唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium, MTT)法测定不同浓度的构树叶总黄酮作用不同时间(24h、48h、72h)对人肝癌HepG-2细胞的生长抑制率。 3在倒置显微镜下观察不同浓度的构树叶总黄酮作用人肝癌HepG-2细胞后的形态学变化。 4采用hoechest33342荧光染色观察不同浓度构树叶总黄酮作用于人肝癌HepG-2细胞48h后细胞凋亡形态变化。 5通过免疫组织化学方法检测人肝癌HepG-2细胞经构树叶总黄酮诱导凋亡过程中的Bcl-2、Bax蛋白表达。 6RT-PCR检测Bcl-2.Bax相关基因经构树叶总黄酮处理前后表达变化。 研究结果 1微波辅助提取法提取构树叶总黄酮,经过分离纯化后,测定提取得率为(139mg/100g)。 2MTT结果显示,构树叶总黄酮对人肝癌HepG-2细胞的生长抑制作用呈现时间依赖性和剂量依赖性。实验组在24小时后,3、6mg/ml构树叶总黄酮对人肝癌HepG-2细胞的抑制作用不明显(P>0.05)9、12mg/ml的抑制作用与对照组相比较,差异具有统计学意义,(P<0.05)。48小时、72小时后3、6、9、12mg l浓度的构树叶总黄酮对人肝癌hepg-2细胞均具有抑制作用,随着浓度的增加,呈时效和量效关系。48h的各浓度抑制率分别为20.2%,29.44%,39.21%,43.96%,将3mg/ml,6mg/ml,9mg/ml,12mg/ml选为实验所用浓度,9mg/ml仅作用48h仅用于细胞的形态学观察="" 3在倒置显微镜下可以看到,对照组人肝癌hepg-2细胞呈梭形,形态饱满,成片排列,胞质丰富分布均匀,细胞核大;细胞经过6mg/ml构树叶总黄酮处理48h后,可观察到,细胞排列紊乱,轮廓不规则,细胞膜皱缩、变园、脱落,细胞内胞质分布不均匀,细胞体积变小,细胞数量变少。hoechest33342荧光染色观察对照组肝癌hepg-2细胞细胞膜完整,细胞核形态饱满,核质染色均一,着色较浅;hepg-2细胞经过12mg/ml构树叶总黄酮处理48h后观察可见,细胞膜发生皱缩,细胞核相对变小,荧光增强明显,细胞核染色质发生浓集并碎裂呈圆形的细胞碎片,此即为凋亡小体,表现典型的凋亡形态特征。=""><0.05)。而凋亡抑制基因bcl-2表达降低,表现为阳性细胞数减少和胞浆着色变浅,细胞核内几乎不见着色。当药物浓度达9mg><0.05)。><0.05) 研究结论="" 1微波辅助提取法是一种高效、节能的提取方法。="" 2构树叶总黄酮对人肝癌hepg-2细胞有明显的生长抑制作用,且抑制作用呈时间依赖性和剂量依赖性。="" 3构树叶总黄酮能够诱导人肝癌hepg-2细胞,可能与上调促凋亡因子bax,以及下调抑制凋亡蛋白bcl-2表达有关。……="">