【个案报道】NTRK1基因新发突变致遗传性感觉和自主神经病4型的遗传学分析及出生缺陷阻断研究

作者：

宋菲 陈大蔚 周平 魏兆莲 曹云霞

作者单位：

安徽医科大学第一附属医院妇产科，合肥 230022

通信作者：

曹云霞，Email：[e-mail]，电话：[phone]

第一作者

宋菲

安徽医科大学医学硕士、妇产科医师，曾获安徽医科大学三好学生、启航奖学金、张锡祺奖学金。

通信作者

曹云霞

安徽医科大学校长，医学博士，主任医师，二级教授，博士生导师，安徽医科大学妇产科学系主任。国家卫生健康委配子及生殖道异常研究重点实验室主任；出生人口健康教育部重点实验室副主任；生殖健康与遗传安徽省重点实验室主任；安徽省生育力保存与人工器官工程技术研究中心主任；安徽省“115”产业创新团队“辅助生殖关键技术应用与推广创新团队”负责人；安徽省学术技术带头人；妇幼健康研究会生殖医学专委会主任委员；安徽省医学会妇产科学会主任委员；中国医师协会生殖医学专委会副主任委员；中国妇幼保健协会生育健康专业委员会副主任委员。享受国务院特殊津贴，卫生部有突出贡献中青年专家。全国先进科技工作者，安徽省“五一”劳动奖章获得者，安徽省省级教学名师。主持包括国家重大基础研究计划、国家自然基金项目在内的国家级和省级课题30余项。

本文刊登于《中华生殖与避孕杂志》

2021, 41(7): 650-654.

摘要

目的    探讨基于二代测序的植入前单体型分析在遗传性感觉和自主神经病4型（hereditary sensory and autonomic neuropathy Ⅳ，HSAN Ⅳ）出生缺陷阻断中的应用价值。

方法    纳入1个HSAN Ⅳ家系，采用高通量测序和Sanger测序相结合的方法对NTRK1基因进行突变分析，通过构建TrkA表达载体对突变进行致病性预测。对活检的囊胚滋养层细胞进行全基因组扩增，选择致病基因上下游数十至数百个单核苷酸多态性位点作为连锁遗传标记，通过基于二代测序的植入前单体型分析完成植入前遗传学检测。

结果    先证者NTRK1基因存在复合杂合突变，包括新发现的移码突变（c.963delG；p.Val321-Valfs*149）和已报道的错义突变（c.850+1G>A），新突变可导致编码蛋白截短与功能失调，其母亲和父亲分别为上述突变携带者。经植入前遗传学检测，活检的2个囊胚中1个携带母方致病基因，1个受累。选择携带母方致病基因的胚胎进行移植，未获妊娠。

结论　本研究是我国NTRK1基因突变行植入前遗传学检测的首例报道，新发现的c.963delG突变丰富了NTRK1基因的突变谱，同时为阻断单基因遗传病出生缺陷的发生提供有效的预防手段。

【关键词】 遗传性感觉和自主神经病4型；先天性无痛无汗症；NTRK1基因；植入前遗传学检测

基金项目：国家重点研发计划（2016YFC1000204-3）

DOI：10.3760/cma.j.cn101441-20201218-00678

 

 

遗传性感觉和自主神经病4型（hereditary sensory and autonomic neuropathy Ⅳ， HSAN Ⅳ）也称先天性无痛无汗症（congenital insensitivity to pain with anhidrosis， CIPA）或者家族性自主神经功能异常2型（familial dysautonomia type Ⅱ），是一种由伤害性神经元缺损和纤维束缺失所致的罕见的常染色体隐性遗传病。该病由Dearborn于1932年首次报道［1］，并由Swanson于1963年正式命名［2］。因极为罕发，目前尚无法统计人群发病率。HSAN Ⅳ患者临床表型多变，且与基因型无显著对应关系，即同一基因型也可表现为不同临床特征［3］。其临床特征之一为痛觉丧失，易导致唇舌咬伤等自残行为以及多种意外伤害的发生，如烧伤、跌落、骨关节损伤或骨髓炎、化脓性关节炎及Charcot关节病等严重并发症［4-5］。HSAN Ⅳ的另一特征为温觉缺乏和无汗症［6-7］，常伴有不明原因反复发热甚至致死性高热，且可于十周岁前出现明显的中到重度智力发育障碍［8］。由于缺乏对疼痛的感知以及智力发育迟滞而发生自残行为，导致舌、指尖咬伤以及反复骨折。大多数HSAN Ⅳ患者均有神经营养络氨酸激酶受体1型（neurotrophic tyrosine kinase receptor， NTRK1）基因突变。NTRK1基因位于lq21-22，其所编码的络氨酸激酶受体（tropomyosin receptor kinase A， TrkA）是神经营养蛋白家族中神经生长因子（nerve growth factor， NGF）的高亲和力受体［9］。

植入前遗传学检测（preimplantation genetic testing， PGT）依据临床应用目的的不同可分为植入前单基因遗传学检测（preimplantation genetic testing for monogenic， PGT-M），植入前非整倍体遗传学检测（preimplantation genetic testing for aneuploidies， PGT-A）以及植入前染色体结构变异检测（preimplantation genetic testing for chromosomal structural rearrangements， PGT-SR）［10］。PGT-M和PGT-SR主要于种植前对胚胎进行活检并筛选正常胚胎进行移植从而避免遗传性疾病的发生，PGT-A则主要用于筛查胚胎的整倍体性，对染色体的数目和结构异常进行检测［11］。

本研究报道了一个NTRK1基因复合杂合突变致HSAN Ⅳ的家系，且检测到全新突变位点c.963delG （p.Val321ValfsX149）。为了避免患儿出生，通过二代测序技术对患病父母进行PGT，这是我国NTRK1基因突变行PGT的首例报道。

资料与方法

1.病历资料：本研究纳入一个包含先证者在内的中国家庭（图1A）。先证者，5岁，第二胎，父母均健康且非近亲婚配。患儿自婴儿期起即表现出严重的无汗症状、痛觉缺失、自残行为以及轻度智力低下，触觉、位置觉和振动觉存在，肌腱反射和足底反射正常，除角膜反射缺失外无其余颅神经损伤，自主神经功能正常。皮肤干燥、粗糙伴轻微角化过度，以手掌和足底最为显著。先证者姐姐无临床症状。

患儿于2015年6月就诊于安徽医科大学第一附属医院，至少2位临床经验丰富的神经内科医生对此病例进行完善的神经系统检查并作出诊断。本研究符合《赫尔辛基宣言》的基本原则，并获得安徽医科大学医学伦理委员会的批准（20160115），患者父母签署知情同意书。采集先证者（Ⅱ-2）及其父母（Ⅰ-1，Ⅰ-2）、姐姐（Ⅱ-1）的外周静脉血，按照试剂盒说明书要求提取基因组DNA（德国Qiagen公司）。

2.突变分析：利用超声波打断基因组DNA并制备文库，通过捕获芯片Human Sequence Capture 2.1M Array （美国Roche NimbleGen公司）对目标基因进行富集，高通量测序仪Illumina HiSeq2000 Analyzers platform （美国Illumina公司）进行连续双向测序，Illumina Pipeline 软件（版本1.3.4）读取原始测序数据，结果通过Burrows-Wheeler Aligner（版本0.5.9）与hg19人类基因组参考序列进行比对。利用Picard软件（http：//sourceforge.net/projects/picard/）标记PCR过量扩增所产生的重复序列，ExomeCNV识别拷贝数变异，SAMtools进行单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism， SNP）以及插入和缺失（insertion and deletion， InDel）的变异检测，并用Annotate Variation （ANNOVAR）注释，通过与单核苷酸多态性数据库（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP）、千人基因组数据库（http：//www.1000genomes.org/）以及100名中国健康成人内部数据库比对，对可疑突变进行筛选，最后利用Sanger测序对高通量测序发现的可疑突变进行验证。

3.表达载体克隆：依据IMAGE clones （英国Source BioSciences公司）构建全长野生型TrkA表达载体。将全长NTRK1 cDNA与pEGFP-C1克隆载体（美国Clontech公司）连接，构建N末端被绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）标记的TrkA表达载体，即野生型TrkA-GFP。由ClonExpress MultiS One Step Cloning Kit （中国南京诺维赞公司）引入突变，引物详见表1。

4.细胞培养和突变致病性预测：以HEK-293细胞作为转染细胞，于DMEM完全培养基（美国Gibco公司）中培养，培养基含10%胎牛血清（美国Gibco公司）、2 mmol/L L-谷氨酰胺（美国Gibco公司）、100 mg/L青霉素-链霉素双抗（美国Gibco公司）。培养环境为含5% CO2的37 ℃培养箱。用Fugene HD转染试剂瞬时转染2.5 μg野生或突变型载体质粒，24 h后收集HEK-293细胞用于RNA提取。对转染后RNA进行逆转录及实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR， qRT-PCR）扩增，引物祥见表1。

5.蛋白质免疫印迹检测：在转染后细胞中加入300 μL缓冲液，通过冰上裂解、离心，取上清于100 ℃煮样，制备获得的总蛋白样品经SDS-PAGE电泳、转膜后，进行免疫反应和化学发光检测，经显影剂显影后定影成图。

6.遗传咨询和PGT：为避免患儿出生，夫妻双方于安徽医科大学第一附属医院妇产科生殖中心就诊咨询，要求行PGT-M治疗。充分了解PGT-M治疗经过及并发风险后，自愿签署知情同意书。经控制性促排卵、取卵、体外受精及囊胚培养和活检，依据单细胞扩增试剂盒（德国Qiagen公司）操作说明书对活检细胞进行全基因组扩增，活检后囊胚予以玻璃化冷冻保存。通过基于二代测序的胚胎植入前单体型分析，选取目标突变上下游数十到数百个SNP位点作为遗传标记，经网站设计引物、DNA纯化、文库构建、高通量测序后，选择正常胚胎进行解冻移植。

结果

测序目标区域覆盖度100%，平均深度189.01。测序结果显示先证者NTRK1基因存在复合杂合突变，包括移码突变（c.963delG；p.Val321-Valfs*149）和错义突变（c.850+1G>A）（图1B）。其中错义突变为已报道的致病性突变［12］，移码突变尚未见报道。Sanger测序验证结果示新发移码突变来自母方，已报道错义突变来自父方（图1B）。父母双方测序结果均证明该突变的遗传方式与常染色体隐性遗传病相符合。先证者姐姐未发现携带致病性突变（图1B）。

患者经控制性促排卵治疗，获卵子11枚，受精2枚，共有2枚囊胚符合活检标准。对活检的囊胚滋养层细胞进行全基因组扩增，通过二代测序技术行植入前单体型分析。结果显示，其中1枚胚胎仅携带母方致病突变，另1枚胚胎同时携带父母双方的致病突变（图2）。经充分协商决定对仅携带母方致病突变的胚胎进行移植，遗憾的是之后未获得妊娠。考虑到女方卵巢功能减退，选择供卵治疗，现已获妊娠。

为了研究新发现的移码突变（c.963delG）对基因功能的影响，我们对野生型及突变型TrkA表达载体进行克隆，qRT-PCR结果显示野生型与移码突变型载体的mRNA表达水平差异无统计学意义（图3A），同时免疫印迹结果显示突变可导致编码蛋白截短（图3B）。免疫荧光染色实验结果提示，移码突变型蛋白在细胞质中定位不均匀，出现细胞质中明显的突变蛋白聚合体（图3C）。

讨论

痛觉作为一种生理防御机制，是多细胞生物感知及规避有害刺激所必不可少的［13］。能够感知有害刺激的一类特殊的感觉神经元被称为伤害感受性神经元。Smeyne等［14］报道，缺乏NTRK1基因的小鼠拥有先天性痛觉不敏感以及排汗功能异常的显著特征，表现为对疼痛刺激无反应但无汗症状不明显［14］。受NTRK1基因敲除小鼠的独特表型所启发，Indo等［15］推测并证实人类TrkA同源基因为HSAN Ⅳ的致病基因。他们在3个HSAN Ⅳ患者的NTRK1基因络氨酸激酶结构域内分别检测到缺失、剪切位点突变以及错义突变。这3名患者彼此无关，但均拥有近亲婚配的父母［15］。以上研究表明，NGF-TrkA通路在人类伤害感受系统的结构和功能发育以及通过排汗实现体温调节的过程中起着至关重要的作用。人类NTRK1基因编码含790或796个氨基酸的TrkA，包括TrkA-1及TrkA-2两种类型，TrkA-1主要在非神经组织中表达，而TrkA-2更常在神经组织中表达，两者无显著功能性差异［16］。TrkA为NGF的高亲和力受体，由3部分组成：胞外结构域，为NGF特异性结合的关键区域；跨膜区，与信号转导相关；胞内结构域，由膜旁区、信号转导所需的络氨酸激酶结构域以及短羧基尾组成［17］。NTRK1突变可造成TrkA结构异常及功能改变，经统计目前已报道的致病性突变有108个，其中约60%编码TrkA的络氨酸激酶结构域，30%编码胞外结构域，仅少数编码跨膜区。由于痛觉神经元和支配汗腺的自主交感神经元其生长发育依赖NGF-TrkA及其下游通路的信号转导，NTRK1基因突变则导致NGF依赖性神经元发生凋亡，表现为痛觉缺失和无汗症［18］。

本研究显示野生型与移码突变型载体的mRNA水平差异无统计学意义，且突变可导致编码蛋白截短，这与生物信息学分析预测一致，即新的移码突变产生新的阅读框，可导致编码蛋白的截短，但对mRNA表达水平无影响。进一步的免疫荧光染色实验结果提示，功能学研究可以明确该变异的致病性。

目前对于HSAN Ⅳ暂无有效治疗方法，现有治疗以对症治疗为主，包括针对发热的物理降温治疗、针对外伤的手术治疗、针对免疫力低下的抗感染治疗以及针对自残行为的心理疏导治疗［19-20］，PGT和产前诊断是预防遗传病患儿出生的主要手段。与有创性产前诊断相比，PGT在胚胎着床前进行，可以避免导致流产的风险。

本研究报告了1个NTRK1基因复合杂合突变致HSAN Ⅳ的家系，并发现1个新的NTRK1基因移码突变，经实验证明该突变可导致编码蛋白截短与功能失调。同时，通过基于二代测序的植入前单体型分析，我们完成了针对NTRK1基因复合杂合突变所致HSAN Ⅳ的PGT，这是我国NTRK1基因突变行PGT的首例报道。综上，本研究新发现的c.963delG突变丰富了NTRK1基因的突变谱，同时为阻断单基因遗传病出生缺陷的发生提供有效的预防手段。

参考文献

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[1]  Dearborn G. A case of congenital general pure analgesia[J]. J Nerv Ment Dis, 1932, 75: 612-615.

[2]  Swanson AG. Congenital insensitivity to pain with anhydrosis. A unique syndrome in two male siblings[J]. Arch Neurol, 1963, 8: 299-306. DOI: 10.1001/archneur.1963.00460030083008.

[3]  Li M, Liang JY, Sun ZH, et al. Novel nonsense and frameshift NTRK1 gene mutations in Chinese patients with congenital insensitivity to pain with anhidrosis[J]. Genet Mol Res, 2012, 11(3): 2156-2162. DOI: 10.4238/2012.May.18.8.

[4]  Wang QL, Guo S, Duan G, et al. Phenotypes and genotypes in five children with congenital insensitivity to pain with anhidrosis[J]. Pediatr Neurol, 2016, 61: 63-69. DOI: 10.1016/j.pediatrneurol.2016.04.006.

[5]  Bar-On E, Weigl D, Parvari R, et al. Congenital insensitivity to pain. Orthopaedic manifestations[J]. J Bone Joint Surg Br, 2002, 84: 252-257. DOI: 10.1302/0301-620x.84b2.11939.

[6]  Franco ML, Melero C, Sarasola E, et al. Mutations in TrkA causing congenital insensitivity to pain with anhidrosis (CIPA) induce misfolding, aggregation, and mutation-dependent neurodegeneration by dysfunction of the autophagic flux[J]. J Biol Chem, 2016, 291(41): 21363-21374. DOI: 10.1074/jbc.M116.722587.

[7]  Axelrod FB. Hereditary sensory and autonomic neuropathies. Familial dysautonomia and other HSANs[J]. Clin Auton Res, 2002, 12 Suppl 1: 12-14. DOI: 10.1007/s102860200014.

[8]  Wang T, Li H, Xiang J, et al. Identification of a novel nonsense mutation of the neurotrophic tyrosine kinase receptor type 1 gene in two siblings with congenital insensitivity to pain with anhidrosis[J]. J Int Med Res, 2017, 45(2): 549-555. DOI: 10.1177/0300060517691699.

[9]  Wehrman T, He X, Raab B, et al. Structural and mechanistic insights into nerve growth factor interactions with the TrkA and p75 receptors[J]. Neuron, 2007, 53(1): 25-38. DOI: 10.1016/j.neuron.2006.09.034.

[10]  Zegers-Hochschild F, Adamson GD, Dyer S, et al. The international glossary on infertility and fertility care, 2017[J]. Hum Reprod, 2017, 32(9): 1786-1801. DOI: 10.1093/humrep/dex234.

[11]  高畅, 杨蕊, 王颖, 等. 植入前遗传学检测技术的现状及新进展[J]. 中华生殖与避孕杂志, 2019, 39(1): 67-74. DOI: 10.3760/cma.j.issn.2096-2916.2019.01.015.

        Gao C, Yang R, Wang Y, et al. Current status and new progress of the preimplantation genetic testing[J]. Chin J Reprod Contracep, 2019, 39(1): 67-74. DOI: 10.3760/cma.j.issn.2096-2916.2019.01.015.

[12]  Mardy S, Miura Y, Endo F, et al. Congenital insensitivity to pain with anhidrosis: novel mutations in the TRKA (NTRK1) gene encoding a high-affinity receptor for nerve growth factor[J]. Am J Hum Genet, 1999, 64: 1570-1579. DOI: 10.1086/302422.

[13]  Dubin AE, Patapoutian A. Nociceptors: the sensors of the pain pathway[J]. J Clin Invest, 2010, 120: 3760-3772. DOI: 10.1172/JCI42843.

[14]  Smeyne RJ, Klein R, Schnapp A, et al. Severe sensory and sympathetic neuropathies in mice carrying a disrupted Trk/NGF receptor gene[J]. Nature, 1994, 368: 246-249. DOI: 10.1038/368246a0.

[15]  Indo Y, Tsuruta M, Hayashida Y, et al. Mutations in the TRKA/NGF receptor gene in patients with congenital insensitivity to pain with anhidrosis[J]. Nat Genet, 1996, 13: 485-488. DOI: 10.1038/ng0896-485.

[16]  Luberg K, Park R, Aleksejeva E, et al. Novel transcripts reveal a complex structure of the human TRKA gene and imply the presence of multiple protein isoforms[J]. BMC Neurosci, 2015, 16(1): 78. DOI: 10.1186/s12868-015-0215-x.

[17]  Indo Y, Mardy S, Tsuruta M, et al. Structure and organization of the human TRKA gene encoding a high affinity receptor for nerve growth factor[J]. Jpn J Hum Genet, 1997, 42: 343-351. DOI: 10.1007/BF02766957.

[18]  Shaikh S S, Chen Y, Halsall S, et al. A comprehensive functional analysis of NTRK1 missense mutations causing hereditary sensory and autonomic neuropathy type Ⅳ (HSAN Ⅳ)[J]. Hum Mutat, 2017, 38(1): 55-63. DOI: 10.1002/humu.23123.

[19]  Bonkowsky JL, Johnson J, Carey JC, et al. An infant with primary tooth loss and palmar hyperkeratosis: a novel mutation in the NTRK1 gene causing congenital insensitivity to pain with anhidrosis[J]. Pediatrics, 2003, 112: e237-e241. DOI: 10.1542/peds.112.3.e237.

[20]  Theodorou SD, Klimentopoulou AE, Papalouka E. Congenital insensitivity to pain with anhidrosis. Report of a case and review of the literature[J]. Acta Orthop Belg, 2000, 66(2): 137-145.