临界点干燥技术是对易损样品进行干燥处理,以便用于扫描电子显微镜检测的有效方法。它能够保护试样的表面结构,在试样经历从液态到气态的转变过程中,避免其表面结构因表面张力而受到损伤。过去,使用临界点干燥技术非常耗时,因为需要进行诸多手动操作,导致试样的再现性非常低。进行干燥前,通常需要对很多生物样品进行固定和脱水处理,干燥后,利用黄金、铂金或钯等金属进行镀膜,令样品表面具备导电性,以供扫描电子显微镜分析之用。
扫描电子显微镜 (SEM) 的用途之一就是生物学领域的表面形态研究,这项研究需要保留试样的表面细节。由于电子显微镜 (EM) 需在真空条件下正常工作,因此,用于电子显微镜成像的样品必须经过干燥处理。样品的水分子会影响真空镜筒,进而妨碍样品成像,此外,它还会在研究中造成样品出现较大程度的变形或受损。水对空气有较大的表面张力。在蒸发(自然干燥)过程中,液、气相界面产生表面张力,会造成切向力,从而对试样的纳米和微观结构发生作用。
临界点干燥技术是保护样品形貌的最先进方法。在临界点处,液相和气相的物理特性无法区分。当化合物处于临界点时,液相与气相的界面消失,液相或气相可相互转化,且能够保持样品不受损。利用处于临界点的水对样品进行脱水的方法不可行,因为水的临界温度是 374 °C,临界压力是 229 个大气压,在这种条件下,任何生物样品都将被破坏。为克服这一难题,可以用液态二氧化碳 (CO2) 代替水,它的临界温度是 31 °C,临界压力是 74 个大气压,更适用于所有生物领域,从技术层面说,也相对容易维持。
但是,CO2 充当过渡液存在一个严重的缺陷;它不可与水混溶。因此,必须用能够同时与水和液态CO2 混溶的交换液来代替水,例如,乙醇、丙酮等。上述交换液的临界点温度较高(乙醇:临界压力:60 个大气压/临界温度:241 °C;丙酮:临界压力:46 个大气压/临界温度:235 °C),因此,不可用于临界点干燥技术。
在样品预处理步骤中,用交换液代替水,然后再用液态CO2代替交换液,随后,液态CO2将达到其临界点,保持恒定的超临界点温度,降低压强,即可让CO2从液相转变成气相。
CO2压力/温度相图
三相点:固态、液态和气态三相物理特性处于共存状态;
临界点/超临界液体:液态和气态共存状态
空气干燥法与临界点干燥技术之间的对比:
空气干燥法制备的样品(水蚤)
CO2 压力/温度相图
CO2 压力/温度相图
CO2 压力/温度相图
CO2 压力/温度相图
CO2 压力/温度相图
CO2 压力/温度相图
CO2 压力/温度相图
CO2 压力/温度相图
CO2 压力/温度相图
标题固定:交联蛋白,增强机械稳定性和热稳定性。脱水:逐步提高交换液浓度以替换样品中的水。CPD:用液态CO2(清洗)代替交换液,随后进行临界点干燥。镀膜:令样品具有导电性,以便进行 SEM 分析。
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