三代测序--中草药篇
2017-12-05 源宜基因
随着技术的不断发展,三代测序已经越来越多的在中草药研究中崭露头角,下面,小编给大家分享一篇利用三代测序技术对传统中草药-丹参进行全长转录组测序的高分文章,看三代测序技术如何助力中草药研究.
研究背景
丹参是一种具有重要价值的传统中药材,尤其是丹参的根中富含大量的丹参酮,其具有重要的生物活性,所以丹参酮的合成研究具有重要意义.过去基于二代测序技术的转录组测序由于读长较短,无法准确获得参与丹参酮合成关键基因的全长cDNA序列,极大限制了丹参酮的生物合成研究.
测序策略
三代测序:丹参根周皮、韧皮部、木质部3种组织提取RNA等量混合进行全长转录组测序,构建小于1kb、1-2kb、2-3kb、大于3kb 的四种文库,利用PacBio Sequel平台测序.
二代测序:根周皮、韧皮部、木质部3种组织分别取样,三次生物学重复,9个样品,利用Illumina HiSeq2500 、PE100测序.
研究思路
研究者利用三代测序对根三个组织的RNA混样测序,获得高可信度的全长转录本序列,进一步利用二代测序对三个不同组织内的基因表达进行定量,获得差异表达基因,阐释了丹参酮在周皮中积累的分子机制.进一步对得到的全长转录本进行可变剪接分析,发现很多萜类化合物及类异戊二烯代谢相关基因发生了可变剪接.
图一  研究思路
研究结果
1. 利用解剖学与液相色谱分析手段,发现丹参酮主要在根周皮组织中积累.
2. 对根周皮、韧皮部和木质部进行全长转录组测序获得223,368条全长转录本.经过进一步去冗余得到160,468条转录本,平均长度为2,059,显著高于二代测序拼接的转录本长度,表明三代测序在获得全长转录本方面有显著优势.
3. 对二代转录组数据进行差异表达基因分析,发现了在根周皮中参与丹参酮合成通路上游的相关基因SmCPS1、SmKSL1、GGPS、IPI等特异性高表达,这也与丹参酮在周皮中的大量积累相吻合,表明丹参酮的合成和积累均发生在根周皮中.通过进一步共表达分析预测到1个2ODD和5个SDRs基因可能参与丹参酮下游的生物合成.
4. 研究者进一步对得到的16,241个高质量的转录本进行可变剪接分析,发现了大约有40%的基因位点发生了可变剪接现象,其中部分基因参与了萜类化合物及类异戊二烯代谢,这暗示着可变剪接可能参与调控丹参酮的生物合成途径.
图二  差异表达和可变剪接分析
可以看到,利用三代测序对中草药进行研究有"四大"步骤:
1: 找出中草药的生物活性成分;
2: 获得该中草药的全长转录本序列;
3: 通过二代RNA-seq找到参与合成该生物活性物质的相关基因和通路;4: 通过全长转录组测序找到调控该生物活性物质的可变剪接、融合基因等事件.
长期以来基于二代测序平台的短读长测序使研究者不能准确获得重要基因的全长转录本序列,本研究利用三代测序获得了大量丹参酮合成通路的全长转录本序列,完善了丹参基因组注释,进一步又利用"三代+二代"进行定量分析,最终阐释了丹参酮的生物合成途径,为合成生物学研究提供了理论基础.
随着三代测序技术在中医药领域的应用越来越深入,科研工作者能够更准确的捕捉到中医药的精华,让传统中医药得到更多学者与民众的认可.
参考文献
Xu Z, Peters R J, Weirather J, et al. Full-length trans-criptome sequences and splice variants obtain-ed by a combination of sequencing platforms applied to different root tiss-ues of Salvia miltio-rrhiza and tans-hinone biosynthesis.[J]. Plant Journal for Cell & Mol-ecular Biology, 2015, 82(6):951.