荧光PCR常见异常结果分析

来源：检验星空

1、首先我们看一下PCR正常扩增曲线，是比较平滑的S型曲线，见下图：

2、常见异常结果分析

2.1 案例1

2.1.1现象：常见单基因翘尾且出现较大的Ct值和单基因翘尾无Ct值现象，见下图：

2.1.2 常见原因：阴性质控曲线翘尾，存在阳性质控或阳性标本污染；样本曲线翘尾，表示目的基因浓度低或者存在非特异性扩增或者存在污染。

2.1.3解决方案：首先排除是否存在污染；排除污染原因后复检样本，如果复检后曲线为阴性直线则说明之前的翘尾为非特异性扩增，如果复检后曲线仍与之前一致则说明该样本中待检病毒核酸的浓度偏低。

2.2 案例2

2.2.1 现象：向PCR反应体系中加入提取好的核酸模板后需要加盖PCR管管盖，由于每天标本量大，难免出现管盖盖得不严的情况。PCR结束以后，出现反应体系中液体减少（见下图2c），各荧光通道均出现扩增曲线呈斜直线型（见下图2a、2b），严重时造成实验室污染。

2.2.2 常见原因：由于管盖没盖紧，反应液蒸发，管内体积减少，读取荧光的标准产生变化，导致曲线呈斜直线上升。

2.2.3 解决方案：操作时，注意盖紧管盖，使用质量合格、管和盖匹配的耗材。

2.3 案例3

2.3.1现象：类似S型的曲线，但不是平滑的典型S型曲线，与阳性质控有明显差异，见下图：

2.3.2常见原因：样本中可能存在干扰物质、提取纯化不完全、PCR仪热盖出现异常等。 

2.3.3解决方案：复测；重新提取，或使用不同试剂盒提取。

2.4案例4

2.4.1现象：不规则的扩增曲线（见下图）：

2.4.2常见原因：整板其他孔位曲线没有异常情况出现，可能该孔位溶液有气泡影响，气泡可以让光路发生折射，在气泡破掉的时候会导致荧光信号发生急剧的变化，干扰仪器对荧光信号的采集。 

2.4.3解决方案： ①加样时减少气泡产生 ；②上机前注意弹掉气泡再离心。

2.5案例5

2.5.1现象：内源性内参曲线异常。

2.5.2常见原因：该孔有异物；温度或荧光信号采集异常；该检测的反应体系中存在抑制物；提取核酸失败；样本采集不合格；样本/核酸漏加。

2.5.3解决方案：打开PCR仪盖，查看孔内是否有异物，假如有异物，用镊子夹出异物，或用洗耳球吹出异物；分析前一批结果中，该孔内标是否扩增，假如连续两次内标无扩增，考虑该孔温度异常或荧光信号采集异常，需要进行校准或报修。排除以上情况后，对原标本复检，若内标正常可以正常发报告；若内标仍然无扩增，则需重新采样复检。

2.6案例6

2.6.1现象：外源性内标曲线异常

外源性加入的内标均一性较好（如G行12孔均有内标曲线，且其CT值均一，见下图）

但工作中有时会发现同一排或同一行中内标比较离散，甚至有多个内标不起（如F行的F7、F9、F10、F11孔均无内标曲线，无CT值，其余各孔CT值比较离散，见下图）

2.6.2常见原因：①排枪与枪头不匹配，结合不严密，导致加样量不足/不均一；②使用排枪吸取内标混合液时，液体堵住了部分枪头滤芯，导致向裂解板加样时加样量不均一，甚至部分孔没有液体加入。

2.6.3解决方案：建议使用配套量程的枪头，移液器要慢放慢吸；分装试剂和加样时仔细观察液体是否打出。