文章来源：中华检验医学杂志, 2023,46(6) : 532-536
作者：王晓娟 马筱玲 吴文娟
摘要
病原微生物感染是全球公共卫生和我国全民健康事业面临的重大挑战，临床微生物检验是通过一系列的检验方法，及时准确地对临床标本作出病原学诊断和抗微生物药物敏感性试验报告，从而为感染性疾病的诊断、治疗和防控提供科学依据。针对不同标本类型、不同的目标病原体和不同的检测系统，建立标准化的检验程序（方法学），并实施规范化的性能验证，是临床微生物实验室质量管理最为关键的环节。为了满足行业需求，国内专家先后编写了《WS/T 639-2018抗菌药物敏感性试验的技术要求》［1］、《CNAS-GL028 2018临床微生物检验程序性能验证指南》［2］等标准和指南，为我国各临床微生物实验室检验工作提供了依据。但近年来，新兴微生物检验技术发展迅猛，自动化接种、染色、鉴定系统，基于核酸和蛋白质组的分子诊断和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）鉴定技术等快速普及，国内外各商品化厂家提供的性能验证方案操作不具体，方法不一致。亟需更新、完善和制定适合我国国情的行业标准，对临床微生物检验各环节和目前微生物实验室使用的各类新型鉴定和药敏系统的检测性能验证方案予以规范；通过提供客观证据，确认微生物检测系统在用于患者标本及标本分离株检测之前能达到临床应用预期的性能；指导我国各级实验室提供可信度高和可比性强的微生物学检测报告。
一、卫生行业标准编写和审批过程
在国家卫生健康委员会法规司和国家卫生健康标准委员会临床检验标准专业委员会的领导下，于2020年9月22日成立了卫生行业标准起草专家组。通过研究国内、外有关临床微生物培养、鉴定和药敏检测系统的性能验证相关的指南、规范和制度［3, 4, 5, 6, 7］，确定了临床微生物检测系统性能验证的基本框架结构，见图1。2022年11月初国家卫生健康委员会法规司公示卫生行业标准的发布，并规定了标准的施行时间为2023年5月1日起。
图1临床微生物检测系统性能验证基本框架结构
二、卫生行业标准关键内容
《WS/T 807-2022 临床微生物培养、鉴定和药敏检测系统的性能验证》卫生行业标准涵盖形态学检查、分离培养、微生物鉴定、药敏试验和分子检测等，特别增加了临床微生物实验室风险评估（包括检测结果错误和性能验证结果错误的风险），通过风险评估梳理了微生物检测系统错误的风险点和危害，从而提醒微生物检验人员采取必要的措施规避风险，这是进行性能验证的根本原因。
在检验目的上，本卫生行业标准的主旨是实验室首次引入新系统或系统部分改变时，通过提供客观证据，确认微生物检测系统在用于患者标本及标本分离株检测之前能达到与临床预期用途或制造商说明书一致的性能。
在检验技术上，与《CNAS-GL028 2018临床微生物检验程序性能验证指南》［2］比较，本卫生行业标准增加了全自动接种仪、染色仪、质谱分析仪和病原体分子即时检测（point-of-care testing，POCT）系统性能验证内容，并制定了详细的系统性能验证方案。性能验证方案以图表列示，更易于理解。本卫生行业标准明确了各项目验证参数和可接受标准，可操作性和考核性更强。
（一）细菌、真菌形态学检查性能验证
1.卫生行业标准增加了细菌、真菌形态学检查性能验证的必要性：临床标本的显微镜形态学检查对鉴定病原体起着“导航”作用。未进行性能验证可能产生以下后果：（1）错误报告细菌的染色性，导致临床选用抗菌药物错误；（2）未检测到标本中的可疑致病菌，延误患者治疗时机，严重者可引起传播风险，如结核分枝杆菌；（3）错误报告假阳性结果，如真菌荧光染色时将纤维误认为真菌菌丝。本标准从验证时机、验证菌株/标本、验证前准备工作、验证方案等几个方面进行了详细的说明，并列表显示常用染色方法和显微镜检查可选取的菌株及验证特征。
2.与《CNAS-GL028 2018临床微生物检验程序性能验证指南》不同之处：与CNAS指南相比，在显微镜检查的性能验证基础上，本卫生行业标准增加了临床微生物实验室常用染色方法如革兰染色、抗酸染色（萋尼法、荧光法）、弱抗酸染色、墨汁染色、真菌钙荧光白染色、乳酸酚棉蓝染色和六胺银染色的性能验证和自动化染片机的性能验证。同时详细列出了验证样品数量和种类要求、验证方案和可接受标准。
在规定样品或标本类型上，CNAS指南主要介绍至少需5份样品，而本卫生行业标准对数量和种类要求更加细化，如在染色方法、显微镜检查和自动化染片机性能验证中，依据应用目的和场景明确规定前两者验证样品分别为5株不同特性的细菌、5份不同来源的临床标本，自动化染片机性能验证则可选择留样标本或菌株。
在考核标准/可接受标准上，如显微镜检查部分，CNAS指南指出能力验证/实验室间比对和实验室内人员比对的考核标准结果符合率应≥80%；而本卫生行业标准针对不同部分的可接受标准不同。在染色方法的性能验证部分，针对染色试剂的性能验证可接受标准为100%。在显微镜检查的性能验证可接受标准为：半定量染色的结果偏差≤±1判断为结果一致；革兰染色、抗酸染色项目符合率应为100%；其他少见染色项目符合率≥80%即合格。在自动化染片机的性能验证部分各标本或菌株染色结果与预期染色性能符合率应为100%。
（二）临床细菌、真菌分离培养和鉴定程序的性能验证
微生物培养鉴定一直是临床实验室能力建设关注的重点。除了全自动血培养系统，本卫生行业标准新增了各种培养基、自动化接种仪、质谱鉴定系统的性能验证要求。从验证时机、验证菌株、验证样本数和判断标准等逐项提出具体要求。并从生物安全和基层单位的实际情况出发，本卫生行业标准未要求必须使用标准菌株，而是要求在明确菌种鉴定正确性的前提下，标准菌株、质控菌株及明确鉴定的临床菌株均可用于性能验证，可依次选择。为便于实验室操作的可行性，卫生行业标准附录A 列表介绍常见标准菌株/质控菌株的培养与保存方法，附录B.2 介绍对于微生物质谱鉴定系统常见的异常情况，列表归纳解释可能的原因，以及相应的解决方法。在全自动血培养仪性能验证部分：（1）在验证菌株数量上，CNAS指南规定的验证菌株数为每种类型至少1株，总体不少于 15 株；而本卫生行业标准规定的数量为最低标准线，即验证每类血培养瓶的菌株数均应至少5株。本卫生行业标准的验证菌株数量，少于CNAS标准，成本更为节省，与卫生行业标准的主旨是规范覆盖基层医疗单位在内的开展临床微生物检验的医学实验室一致。本卫生行业标准同时以列表的形式展示需氧瓶、厌氧瓶、儿童瓶、真菌瓶和分枝杆菌瓶应覆盖的细菌种类，更为清晰且可操作性强。（2）在可接受标准方面，CNAS指南规定与参考方法相比，新培养系统检测符合率至少为 95%；而本卫生行业标准规定了当全自动血培养系统能够在厂家规定的时间内，80%（5株菌中至少4株菌）以上可准确检出即通过验证。这一标准符合我国当前大多基层医疗单位采用国产血培养仪的基本国情。
在微生物鉴定系统的性能验证部分，本卫生行业标准详细列出了全面验证和部分验证的适用范围，并以表格的形式详细展示了全面验证和部分验证的验证参数和可接受标准等。除了CNAS指南规定的符合率（准确度）要求以外，卫生行业标准增加了精密度验证的要求和判断标准。（1）在验证菌株数量上，CNAS指南规定每种类型应至少 1株，总体不少于 20 株。而本卫生行业标准规定准确度验证中的全面验证和部分验证的菌株数分别为至少30个临床菌株和至少10个临床菌株；精密度验证中的全面验证为至少应3个工作日，重复对5个菌株（质控菌株和/或临床菌株）进行测试；部分验证为1 d测试3次适用于本次方法学变更的质控菌株。（2）在可接受标准方面，二者在准确度方面要求一致；精密度验证中全面验证为在3个工作日测试5个菌株（质控菌株和/或临床菌株），至少14个鉴定结果一致则验证通过；部分验证为质控菌株鉴定结果应全部符合。
CNAS指南主要适用于商业化配套的传统生化鉴定系统，本行业标准的重要更新之一，是新增了质谱鉴定系统的性能验证要求，针对质谱分析系统病原数据库的广泛性和前处理方法的特殊性，提出了专门的验证要求。除了以微生物类别为基础的准确度验证外，要求精密度验证包括所有可能存在的主要变量，如不同的培养基、培养条件和提取技术，以及评估批内、批间、操作者之间以及连续几天的重复性或再现性。
（三）微生物药敏系统的性能验证
药敏试验检测的性能验证是临床工作中的重点和难点，既往临床实验室对室内质控和性能验证方案经常混淆。尤其在耐药表型的检出能力验证上，存在疏忽遗漏。本卫生行业标准介绍了微生物药敏系统相关术语、性能验证的执行规则、药敏准确度验证方案、精密度验证方案、性能验证期间的质量控制，并给出了结果分析及矛盾结果的解决方案。验证时机可分为全面验证和部分验证。实验室引入经药监部门批准的、未经修改的商品化检测系统时，使用前应进行全面验证。实验室使用中的检测系统，对试剂、数据库、分析软件和硬件等进行升级后，增加药物稀释浓度以覆盖药物新折点时，应进行部分验证。
在本章节内容中，详细规定了药敏检测系统验证菌株数量及具体要求，为每种药敏板至少测试30株菌。应尽可能选择临床菌株，包括特殊或少见耐药表型菌株，所选质控菌株的数量不应超过菌株数量的50%。附录B以表格的形式具体展示了药敏检测系统准确度和精密度全面验证和部分验证所需菌种和菌株数量及可接受标准。附录C提供了全自动微生物药敏检测系统性能验证示例，表C.1以表格形式提供比较新系统与现有系统的全面验证方案。在本卫生行业标准在第2章规范性引用文件处列出了另一项卫生行业标准《WS/T 639-2018抗菌药物敏感性试验的技术要求》，表示执行本卫生行业标准的同时应遵循《WS/T 639-2018抗菌药物敏感性试验的技术要求》相关内容规定。
（四）分子 POCT 系统和部分感染免疫学试验的性能验证
分子生物学检测被认为是诊断难以培养病原体的金标准，已在微生物检验中被广泛应用。其中POCT作为国际上检验医学的新理念和热点，具有设备体积小，速度快、操作便捷，一体化封闭设计，可直接放置在微生物实验室的特点。POCT的质量规范已纳入ISO15189∶2022更新版准则。本行业标准也对微生物检测分子POCT系统的性能验证进行了规范。要求验证样本有可溯源性、适用性、匀质性，验证项目的选择可以根据实验室情况针对性选择。验证方案设计应涵盖人员、检测系统、试剂的要求。由于POCT一体化设备通常不能拆卸校准，使用者应了解所用检测系统的特性，确保检测系统在安装调试后、在实验室的常规环境和使用下的性能与预期一致。本卫生行业标准只提出一般要求，对于某些特殊靶标或多重检测系统，可不限于卫生行业标准内容而根据需要进行验证。结合当前国内临床微生物实验室普遍开展的艰难拟梭菌、真菌和结核分枝杆菌等感染免疫项目，本卫生行业标准推荐的性能验证方案基本遵循CNAS免疫学检查的性能验证要求。
在卫生行业标准的宣贯期间，很多临床微生物工作者反馈易于混淆性能验证、比对和室内质控/室间质评等概念。为了便于临床微生物工作者更好地理解检验程序性能验证/确认与日常质量保证计划的区别，本文以药敏试验为例，从目的、时机、样品/菌株、测试数量、判断标准和操作者6个方面进行了比较，见表1。
（五）卫生行业标准的应用和挑战
本标准适用于开展临床微生物检验的医学实验室。本标准的发布和实施，符合我国当前的国情。卫生行业标准起草组通过京港感染论坛和中国医师协会全国检验年会等平台，对卫生行业标准进行了宣贯，并多层次多渠道收集意见、了解各地各级实验室的反馈。目前卫生行业标准实践和推广中的挑战主要有：（1）实验室工作人员对性能验证的重要性和潜在风险评估不足。有的实验室为了应付检查，请设备厂商或经销商代为完成，没有真正落实验证程序。（2）卫生行业标准宣贯的频度和力度不够，没有配套的检查、考核和追责措施，新卫生行业标准的知晓率不高。（3）检验人员对性能验证、性能确认、室内质控、能力验证和结果比对等实验室活动的定义、目的、操作程序和评价标准等概念模糊不清。不知道什么情况下应该做性能验证，应该做全面验证或是部分验证。（4）实验室为了节约人力、时间和试剂，不愿意做性能验证。（5）检验人员对质谱鉴定、分子POCT系统等新技术的检测原理、操作方法、关键参数和影响因素等不熟悉，无法开展性能验证。（6）实验室没有足够的，满足性能验证要求的菌株。由此可见，标准发布后，后期培训和能力建设仍需不断完善，以期推动涵盖基层医疗机构在内的全国临床微生物检验程序的规范化，保证微生物检验结果的可信度和可比性，为临床感染性疾病快速诊治和公共卫生防御提供坚实基础。
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