​SOP文件 | 革兰染色标准操作规程

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1. 目的

规范革兰染色标准操作规程。

2. 原理

细菌样本先经紫色草酸盐结晶复合物染色，之后用 Lugol- PVP 媒染剂处理以促进染料与革兰阳性菌的结合。经乙醇丙酮的脱色作用，革兰阴性菌中的结晶紫会被洗脱。番红精则是作为复染剂：革兰阴性菌呈现粉红色，而革兰阳性菌呈现紫色。

3. 试剂

3.1. 结晶紫草酸盐溶液：结晶紫 2%、乙醇20%、草酸 0.8%。

3.2. 稳定 Lugol-PVP复合物：碘 1.3%、碘化钾2%、PVP（聚乙烯咯烷酮）10%。

3.3. 脱色剂：95%乙醇50%、丙酮 50%。

3.4. 番红精溶液：番红精0.25%、95%乙醇 10%。

4. 操作步骤

4.1. 初染：第一液初染剂（结晶紫）染色 10s、水洗

4.2. 媒染：第二液媒染剂（碘液）染色 10 s，水洗。

4.3. 脱色：第三液脱色剂（95%乙醇）脱到无紫色脱落为止，10~20s水洗。

4.4. 复染：第四液复染剂（石炭酸复红或沙黄）染色10s，水洗。自然干燥后镜检。

5. 质量控制

5.1.采用大肠埃希菌 ATCC25922质控标准菌株，每周1次有室内质控记录。

5.2. 采用金黄色葡萄球菌 ATCC 25923 质控标准菌株每周1次有室内质控记录。

6. 结果判断

革兰阳性菌呈紫色，革兰阴性菌呈红色。

7. 注意事项

7.1. 染色的结果常受操作者技术影响，尤其是容易过度脱色，往往阳性染成阴性。

7.2. 在同一载玻片上，需用已知金黄色葡萄球菌及大肠埃希菌做阳性及阴性对照。

7.3. 染色关键在于涂片和脱色,涂片不宜过厚，固定不宜过热，脱色不宜过度。

7.4. 菌龄以18~24h为佳。

8. 用途

8.1. 鉴别细菌：可将细菌分为阳性和阴性两大类，因而可以初步识别细菌,缩小范围，有利于进一步鉴定。

8.2. 选择药物：革兰阳性菌与阴性菌的细胞壁结构有很大差别，因而抗菌药物有差异。