β-catenin免疫组化染色

       摘要  β-catenin免疫组化染色在一些肿瘤包括韧带样型纤维瘤病(DTF)的诊断中可能有价值。淋巴样增强因子1(LEF1)是一种新近出现的因子，与β-catenin一起成为Wnt通路的一部分，但在DTF中还没有被研究。我们使用组织微阵列和全切片对26例DTF、19例浅表性纤维瘤病、12例硬化性肠系膜炎、17例胃肠道间质瘤和14例皮肤瘢痕进行了LEF1和β-catenin免疫组化染色。染色强度分为强(2倍视野下可见，评分3)，中(4倍视野下可见，评分2)，弱(10倍视野下可见，评分1)和阴性(10倍视野下未见，评分0)。核阳性的百分比以10%增长为记录。组织学评分根据阳性强度的数值乘以细胞核阳性百分比。评分至少为10分的定义为阳性。25例DTF中LEF1阳性18例，而β-catenin阳性12例(1例因组织丧失而除外)。胃肠道间质瘤均不表达该2个标记。所有浅表性纤维瘤病除了2例呈弱阳性表达LEF1但不表达β-catenin外均为阴性。仅有2例硬化性肠系膜炎弱阳性表达LEF1单不表达β-catenin。14例瘢痕中10例阳性表达LEF1，但仅1例弱阳性表达β-catenin。总之，该项研究证实LEF1在某些情况下可成为DTF鉴别诊断中一个有价值的标记物。然而，需要注意的是LEF1也可能见于瘢痕组织中。

　　Wnt通路不仅在正常胚胎发育而且在许多人类恶性肿瘤中发挥重要作用。作为经典通路的一个重要成分，在数个其他成分包括结肠腺瘤性息肉病(APC)的帮助下，胞质β-catenin与Axin复合体紧密结合与蛋白酶体的降解命运密切相关。然而，当该通路被活化时， β-catenin从Axin复合体中释放出来，由于降解停止而积聚于胞质，并再定位到细胞核。T细胞因子(TCF)/淋巴增强因子(LEF)转录因子家族在与核内的β-catenin相互作用后通过活化Wnt靶基因包括c-MYC和CCND1而成为经典Wnt通路的主要效应子。作为TCF/LEF1家族的一个成员，LEF1也参与了许多正常结构和细胞包括皮肤附件、牙齿和淋巴细胞的发育。

　　韧带样型纤维瘤病(DTF)是一种局部侵袭性肿瘤，通常发生于深部软组织，特征为浸润性生长和高复发率。根据解剖部位，该肿瘤能分为腹腔内、腹壁和腹壁外等类型。近95%DTF具有APC或CTNNB1基因的突变，后者编码β-catenin蛋白。应用免疫组化(IHC)检测到β-catenin核阳性可作为DTF的APC或CTNNB1突变的一种替代标记物。相反，掌跖纤维瘤病虽然免疫组化仍显示β-catenin核阳性，但它们没有这些突变。β-catenin核染色对于区分DTF与其可能的拟似病变如胃肠道间质瘤(GIST)和硬化性肠系膜炎具有一定价值。然而，根据我们的经验，β-catenin核染色由于核染色被强的膜染色掩盖而欠佳和难以解释，有些病例胞质阳性并不少见。最近，LEF1免疫染色，一种仅核染色的标记物，开始在诊断病理学中被应用。由于其与β-catenin密切相关，因而LEF1在一些具有APC和/或CTNNB1突变的肿瘤如结直肠癌、胰腺实性假乳头瘤和鼻咽血管纤维瘤中染色阳性并不奇怪。因此，我们假设LEF1也可在DTF的鉴别诊断中是一种有价值的标记物，由于明确的染色和容易判断而可能取代β-catenin。

　　1  材料和方法

　　1.1  病例选择  略

　　1.2  免疫组织化学方法  略

　　1.3  评分  IHC染色结果由作者中的2位进行评估(Y.Z.和X.L.)。仅有核染色才判定为LEF1和β-catenin阳性。阳性强度被评分为强(×2倍视野明确可见，数值为3)，中(×4倍视野明确可见，数值为2)，弱(×10倍视野明确可见，数值为1)和阴性(×10倍视野未见，数值为0)。阳性细胞核的百分比以10%增长为记录为从0%到100%。组织学评分根据每张切片上阳性强度的数值乘以百分比来确定。对于微阵列，对2个组织芯独立进行评分，然后取其平均分。如果1个组织芯不能评分，则组织学评分来自于剩余的组织芯。2个组织芯都不能进行评估的则从本研究中除去。至少10分(弱阳性，评分1分，10%肿瘤细胞核阳性)定义为阳性。阳性被进一步分为强阳性(SP，组织学评分200-300)，中等阳性(MP，100-199)和低阳性(LP，10-99)。配对双尾T检验用于判断组织学评分的差异是否显著(P<>

　　2  结果

　　LEF1和β-catenin的IHC染色在26例DTF、19例掌跖纤维瘤病，12例硬化性肠系膜炎，17例GIST和14例瘢痕组织中进行。1例DTF由于在TMA制作时组织丧失而排除。

　　在剩余25例DTF(24例TMA，1例全切片)，1例有2个LEF1组织芯，但β-catenin组织芯仅1个。另1例仅有1个LEF1和β-catenin的组织芯。其余22例TMA病例都有2个LEF1和β-catenin染色的组织芯。

　　对于DTF， LEF1表达为LP者28%(7/25)、MP者28%(7/25)、SP者16%（4/25）和阴性者28%(7/25)。相反，β-catenin表达为LP者28%(7/25)、MP者12%(3/25)、SP者8%(2/25)和阴性者52%(13/25)(表1)。LEF1和β-catenin的平均组织学评分和SD分别为85.4/84.9和45.2/80.5。使用配对的双尾t检验没有统计学差异(P=0.05)。一致性LEF1he β-catenin染色见于60%(15/25)病例(图1A-C)，而32%(8/25)病例显示LEF1阳性，而β-catenin染色阴性(图1D)，8%(2/25)则表现为相反的结果(表2)。

　　表1 LEF1和β-catenin在DTF中的染色结果

　　DTF是指韧带样型纤维瘤病；LEF1，淋巴样增强因子1；LP，弱阳性；MP，中等阳性；SP，强阳性

图1. A,韧带样性纤维瘤病HE染色(×20倍). B,同一病例LEF1染色显示中等强度核阳性(×40倍). C, 同一病例β-catenin染色显示中等强度核阳性(×40倍),注意同时伴有胞质强阳性. D,另1例韧带样型纤维瘤病LEF1染色显示强的核阳性(×20倍). LEF1是指淋巴样增强因子1

表2  β-catenin和LEF1阳性在DTF中的比较

　　DFT是指韧带样性纤维瘤病；LEF1，淋巴样增强因子1

　　LEF1在12例硬化性系膜炎病例中仅有2例阳性(7%)(2例为活检/全切片，LP，评分分别为10和20，见图2A)，平均评分为2.5，SD为6.2，β-catenin在所有病例均为阴性。LEF1和β-catenin在硬化性系膜炎中的表达没有统计学差异(P=0.19)。在19例掌/跖纤维瘤病中，2例(11%)显示LEF1的LP(评分为10和15)，平均评分为2.0，SD为4.0，所有病例均不表达β-catenin。这2个标记在浅表性纤维瘤病中的表达没有统计学意义(P=0.05)。GIST中均无LEF1和β-catenin的核染色。

　　14例瘢痕中有10例(71%)阳性表达LEF1(LP 5例，MP 5例)，平均评分65，SD为59（图2B），仅有1例阳性表达β-catenin(评分10分，平均=0.7，SD=2.7)，二者之间由明显的统计学意义(P=0.001)。由于这个意外的发现，我们复习了这些病人的病史，表3和4提供了一些临床病理学特征。10例病人在电子病历中记录有不同原因的手术史。剩余4例无明确记录以前的手术史。在10例有明确记录有以前手术史的病例中，6例是由于其有皮肤病，其余4例由于各种原因如乳腺癌重建、腹壁疝修补术、非治愈性创伤和胰腺切除术史。

　　散在的强阳性淋巴细胞作为内对照。令人感兴趣的是，一些血管内皮也表达LEF1。

表2.A，LEF1在硬化性系膜炎中的染色表现为罕见的细胞呈弱阳性(×40倍)，注意左下角的钙化。B,LEF1在瘢痕中的染色为中等阳性(×40倍)，注意右上角的汗管。LEF1是指淋巴样增强因子1.

　　表3  LEF1免疫染色与初次手术及瘢痕切除时间的关系

　　LEF1是指淋巴样增强因子1

　　表4 无明确以前手术史的瘢痕病例

　　LEF1是指淋巴样增强因子1

　　3  讨论

　　DTF是一种中间恶性的纤维母细胞性肿瘤，可能具有局部复发，但无转移潜能。多项研究明确该肿瘤由于存在CTNNB1或APC基因突变而导致β-catenin核表达，这是在选择性病例的诊断中一种有价值的诊断线索。一些研究表明其有82%-100%的敏感性。然而，根据我们的经验，β-catenin的染色由于伴随和常掩盖性的细胞膜和胞质染色而通常难以解释。本研究中，相比于β-catenin的48%敏感性，LEF1的敏感性为72%。LEF1也有较高的平均组织学评分，较多病例至少为中等强度阳性，高于β-catenin的染色(44%对20%)。DTF可能的拟似病变如GIST何硬化性系膜炎大多不表达LEF1。掌和跖纤维瘤病，缺乏β-catenin突变，也大多数不表达LEF1.这些发现证实了LEF1的特异性。 β-catenin较低的阳性率可能是由于TMA的特征或进行免疫染色上的技术差异。虽然有较多的诊断GIST较特异的标记物如CD117和DOG1，但LEF1将在DTF与硬化性系膜炎的鉴别中最有价值。

　　LEF1最初作为一种通过高迁移率基团(HMG)盒与T细胞受体-α增强子内的一个功能重要位点结合的蛋白而发现的，而HMG盒与HMG蛋白1(HMG1/HMGA1)具有同源性。作为哺乳动物TCF/LEF家族(与TCF1、TCF3和TCF4)4个成员中的1个，LEF1与Groucho/TLE1和组蛋白去乙酰化酶(HDAC)一起作为Wnt靶基因的转移抑制因子而发挥作用。然而，当β-catenin积聚于胞质内并转移到细胞核时，其结合TCF1/LEF1和活化促进细胞增殖和存活的靶基因转录。LEF1基因是前B细胞、T细胞、牙齿和皮肤附件发育所必需的。Lef1纯合性胚系突变导致产后死亡和牙齿、乳腺、胡须、毛发，以及小鼠三叉神经的中脑核的缺失。在另一项研究中，突变的LEF1在表皮内的选择性表达导致毛发脱落和具有皮脂腺形态的皮肤肿瘤发生。有趣的是，LEF1的失活性突变也见于一些人皮脂腺肿瘤中。

　　本研究中一个意想不到但有兴趣的发现是LEF1在瘢痕内呈阳性表达。瘢痕形成和纤维化是一种复杂的过程，涉及到上皮-间叶转化，在这个过程中一些因子如TNF-α或通过β-catenin依赖性经典通路或者Sma和Mad相关蛋白2的直接激活，通过TCF-LEF复合体而抑制E-cadherin表达。在Madin-Darby牛肾细胞系中的一项研究也显示LEF1能够不依赖于β-catenin而诱导上皮-间叶移行。有兴趣的是，长期以来注意到DTF易于在外科手术部位发生。在家族性腺瘤性息肉病(FAP)中，由APC突变导致的综合征大约有10-20%病人最终发展为DTF，有报道这些病人通常在预防性结肠切除术后5年内，DTF的发生率接近80%。另一项研究提示行腹腔镜下结肠切除术病人比那些行开放性结肠切除术病人具有较低的DTF发生率。根据我们瘢痕病人的临床信息，似乎可以发现LEF1染色评分大概与瘢痕的“年龄”呈负相关，这是自产生瘢痕的手术以后的时间。假设LEF1在创伤修复和纤维化早期被活化，或以β-catenin依赖性(未应用β-cateninIHC检测)或非依赖性形式和通过LEF1免疫染色检出，随着瘢痕成熟而下降。有可能的是由于异常Ent信号，FAP病人瘢痕形成的过程并不是密切调控的，而最终导致以DTF形式的失控性和单克隆性生长，组织学检查上非常类似于瘢痕。LEF1在瘢痕形成中的作用，特别是FAP病人需要进一步研究。

　　LEF1免疫染色仅在最近被认为是一种有价值的诊断标记物，特别是在造血系统病理学领域，研究发现其IHC表达于慢性淋巴细胞性白血病/小淋巴细胞性淋巴瘤。一些其他研究调查了其在其他肿瘤包括结直肠癌、造釉细胞瘤样颅咽管瘤、实性假乳头状肿瘤、毛母质瘤、钙化性囊性牙源性肿瘤和基底细胞腺瘤/腺癌。未来的研究需要确定LEF1免疫染色在这些肿瘤中的表达状态以及与临床病理特征和预后的关系。

　　虽然瘢痕内LEF1阳性限制了其在DTF鉴别诊断中的价值，但在某些情况下LEF1染色可有价值。没有近期手术史或严重创伤的深部病变不太可能出现瘢痕，阳性染色更加可靠和可信。而且但β-catenin染色显示不明确的结果时，伴随的LEF1染色结合仔细的形态学观察将有价值。

　　总之，我们确定了LEF1在DTF与硬化性系膜炎和GIST的鉴别诊断中是一种潜在的有价值标记物，除了明确的核染色外，至少与β-catenin具有同样的敏感性。一个意想不到也是一个潜在的陷阱是LEF1在许多瘢痕中也阳性，这种情况需要将来另外的研究。然而，这个发现在区分浅表性纤维瘤病与手术后瘢痕中可能有价值，因为LEF1阳性染色更加支持瘢痕。

　　原文出处：Zou Y, Zhang Y, Church J, et al. Comparison of b-Catenin and LEF1 Immunohistochemical Stains in Desmoid-type Fibromatosis and its Selected Mimickers, With Unexpected Finding of LEF1 Positivity in Scars. ?Appl Immunohistochem Mol Morphol, 2018,26(9):648-653.