【摘要】目的：探讨子宫颈上皮内瘤变（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）与子宫颈癌组织中细胞周期抑制因子p16蛋白及特异识别病毒复制的中间产物TLR3的表达及意义。方法：采用免疫组化SP两步法检测19例正常子宫颈、62例CIN及17例子宫颈鳞癌中p16和TLR3的表达。结果：正常子宫颈、CIN及子宫颈鳞癌中p16的阳性率分别为0、72.5%、100%，各组间差异有统计学意义（P＜0.01）；TLR3阳性率分别为26.3%、87%、100%，各组间差异有统计学意义（P＜0.01）；p16及TLR3的表达呈显着正相关（rs=0.538，P＜0.01）。结论：p16和TLR3在CIN及子宫颈癌组织中表达较正常鳞状上皮均显着提高，且p16及TLR3的表达与CIN级别相关，可为早期子宫颈癌的病理诊断提供实验依据。
子宫颈癌是常见的女性恶性肿瘤之一，大量的流行病学资料显示，子宫颈癌通常在35岁以后发病，近年来，多发于40～60岁，35岁以下妇女子宫颈癌发病率以每年2%～3%的速度增长［1］。目前常用的筛查手段TCT检查及HPV检测－阴道镜检查－子宫颈锥切或LEEP手术，宫颈活检病理诊断筛查效果十分明显，可提高子宫颈上皮内瘤变（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）、子宫颈原位癌及早期浸润癌的检出率，有效地预防子宫颈浸润癌的发生，提高患者生存质量，但同时也存在过度治疗的问题。随着对生物标志物的关注，细胞周期抑制因子p16蛋白及Toll样受体3（TLR3）的分析对子宫颈癌的早期发现具有一定的临床意义。本文采用免疫组化SP两步法对正常子宫颈、CIN及子宫颈癌中p16蛋白及TLR3的表达进行分析，探讨二者的表达及其相关性。
1、材料与方法
1.1 材料
收集安徽省妇幼保健院2010年1月～2014年11月活检组织病理诊断为正常子宫颈、CIN1～3及子宫颈鳞癌标本合计98例。所有标本均经安徽省妇幼保健院
病理科两位资深病理医师复阅全部病理切片后，参照WHO（2003）女性生殖系统肿瘤病理学和遗传学分类标准确诊。
1.2 主要试剂及仪器
所有组织均经10%中性福尔马林固定、石蜡包埋，4μm厚连续切片。免疫组化染色采用PV6000两步法，枸橼酸盐缓冲液热抗原修复，DAB显色，苏木精复染。p16、TLR3采用PV6000试剂盒（北京中杉金桥公司）进行免疫组化染色。用PBS代替一抗为阴性对照，用已知阳性切片做阳性对照。DAB显色剂、PBS等试剂均购自北京中杉金桥公司。
1.3 评判标准
p16阳性表达为胞核和（或）胞质着棕黄色。TLR3阳性产物主要表达于胞质和（或）胞核内，为棕黄色颗粒。免疫组化结果的判定标准参照文献，根据着色度及阳性百分比进行评分：无着色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分；阳性细胞＜5%为1分，5%～25%为2分，26%～50%为3分，≥50%为4分。两项相加为最终评判标准：1分为阴性（－），2分为弱阳性（+），3分为中等阳性（++），4分以上为强阳性（+++）。
1.4 统计学分析
采用SPSS19.0软件进行统计学分析，组间表达差异比较采用秩和检验，指标间关系采用Spearman相关性分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。
2、结果
2.1 p16、TLR3
在子宫颈各类型病变中的表达与分布CIN1中p16蛋白表达主要定位于上皮1/3以内区域，CIN2中p16蛋白表达主要定位于上皮1/3～2/3之间局域，CIN3中p16蛋白表达主要定位于上皮大于2/3区域，而子宫颈鳞癌组织则全部表达。CIN1中TLR3蛋白表达主要定位于上皮1/3以内区域，CIN2中TLR3蛋白表达主要定位于上皮1/3～2/3之间局域，CIN3中TLR3蛋白表达主要定位于上皮大于2/3区域，而子宫颈鳞癌组织则全部表达（表1，图1、2）。
图1 p16蛋白在子宫颈各类型病变中的表达，SP法：A.CIN1；B.CIN2；C.CIN3；D.子宫颈鳞癌
图2 TLR3在子宫颈各类型病变中的表达，SP法A.CIN1；B.CIN2；C.CIN3；D.子宫颈鳞癌
表1 p16、TLR3在子宫颈各类型病变中的表达
| 病理类型 | n | p16表达 | TLR3表达 |
| - | + | ++ | +++ | 阳性率（%） | - | + | ++ | +++ | 阳性率（%） |
| 正常子宫颈 | 19 | 19 | 0 | 0 | 0 | 0.00 | 14 | 5 | 0 | 0 | 26.3 |
| CIN1 | 17 | 12 | 4 | 0 | 1 | 29.4 | 4 | 11 | 2 | 0 | 76.5 |
| CIN2 | 22 | 5 | 1 | 7 | 9 | 77.3 | 4 | 12 | 5 | 1 | 81.8 |
| CIN3 | 23 | 0 | 0 | 4 | 19 | 100.0 | 0 | 8 | 7 | 8 | 100.0 |
| 子宫颈鳞癌 | 17 | 0 | 0 | 6 | 11 | 100.0 | 0 | 3 | 6 | 8 | 100.0 |
2.2 p16
在子宫颈各类型病变中表达p16蛋白在CIN中的表达主要定位于细胞核和细胞质。p16在正常子宫颈对照组中几乎不表达，在子宫颈鳞癌组织的阳性率为100%，在CIN1组中阳性率为29.4%（5/17），在CIN2组中阳性率为77.3%（17/22），在CIN3组中阳性率为100%（23/23），各组间差异具有统计学意义（P＜0.01）。
2.3 TLR3
在子宫颈各类型病变中表达TLR3蛋白阳性信号主要表达于胞质和（或）胞核内，为棕黄色颗粒。TLR3在正常子宫颈组织中阳性率为26.3%（5/19），子宫颈鳞癌组织中阳性率100%，在CIN1组中阳性率为76.5%（13/17）、在CIN2组中阳性率为81.8%（18/22）、在CIN3组中阳性率为100%（23/23），各组间的差异具有统计学意义（P＜0.01）。
2.4 子宫颈各类型病变中p16与TLR3的相关性
Spearman相关性分析显示：98例子宫颈病变组织中p16及TLR3的表达均呈显着正相关（rs=0.538，P＜0.01）。
3、讨论
女性生殖器官恶性肿瘤居十大癌症排列的首位，子宫颈鳞癌是常见的妇科恶性肿瘤，是继乳腺癌之后的女性高发恶性肿瘤。高危型HPV持续感染是子宫颈癌的主要危险因素［1］。90%以上的子宫颈癌伴高危型HPV感染；目前对于HPV的传播，检测技术和诊断水平以及人们防治癌症意识的提高，子宫颈癌的发病率略有降低，而CIN的发病率逐年上升。早期诊断并予以恰当的治疗CIN，可阻止其发展为子宫颈鳞癌，并有望彻底治愈。根据美国国家综合癌症网络子宫颈癌筛查指南，对于CIN1患者的处理，即门诊随访观察，有资料显示CIN1患者可自然转归正常［2］；对于CIN2、3患者主要是采取局部治疗，行LEEP手术或子宫颈锥切手术，而LEEP手术或子宫颈锥切手术也有一定的风险，可能会引起子宫颈粘连、子宫颈缩短；过度治疗对于需要妊娠的患者，可能会带来生育的隐患。随着对生物标志物的关注，p16及TLR3越来越引起人们的重视，有望明确诊断CIN的级别，早期发现子宫颈鳞癌，杜绝过度治疗［3］。
p16基因定位于人染色体9p21区，由2个内含子及3个外显子组成，为细胞周期依赖性激酶（CDK-4）的抑制蛋白，它通过在细胞G1-S期的减速，直接参于细胞增殖的负调节；p16基因不仅通过抑制细胞周期蛋白D-CDK4/6的催化反应，且干扰细胞周期蛋白D-CDK4/6的集合，从而发挥抑癌的作用。近期有研究显示［4］，p16在子宫颈癌的异常上皮细胞中过表达，而在正常或良性病变的子宫颈上皮不表达。在HPV阳性的肿瘤细胞中，p16通过抑制D型细胞周期蛋白、HPV癌蛋白E7、视网膜母细胞瘤蛋白（pRb）的反馈调节通道，抑制其活性组织细胞进入G/S期，无限制扩增向肿瘤发展和转化，从而发挥抑癌的作用。pRb是调节蛋白、肿瘤抑制因子，专门绑定在细胞周期蛋白D-CDK4/6的复合体，从而防止被pRb磷酸化激活后的构象改变，从E2F/pRb复合体中释放转录因子E2F，抑制细胞进入S1阶段。pRb由于E7癌基因的功能失活，推动细胞进入细胞周期阶段，细胞周期蛋白依赖激酶的活性增加，使正常细胞周期在G1期至S期停滞时间减少，在细胞未成熟时就开始分化，导致细胞癌变。一旦p16基因缺失、突变等导致功能缺失，则不能抑制CDK4，最终导致细胞进入恶性增殖，加速肿瘤发生。近年研究显示［5］，抑癌基因p16在99%高危型HPV阳性的子宫颈癌和癌前病变中过表达，因此可将p16蛋白作为生物学标志物用作子宫颈癌早期筛查。
本组结果显示，p16在正常子宫颈组织中不表达，在病变子宫颈中均有表达，随着CIN级别的升高以及发生癌变，阳性率逐渐升高；在CIN1、2组与子宫颈鳞癌组之间差异有统计学意义，CIN3组与子宫颈鳞癌组之间差异无统计学意义，提示p16在CIN3组与子宫颈癌组以强阳性表达为主，在CIN3向子宫颈癌前转化的过程中，就有强阳性表达，在CIN1、2组以弱阳性为主，提示p16基因失活与子宫颈癌的发生有关，且可能参与子宫颈癌演变的早期阶段，可作为CIN筛查及
病理诊断的生物学标记。
人TLR3基因定位于4q35，全长为3029bp，主要有两种转录产物：4.0、6.0kb的mRNA，与其他TLR家族成员一样，TLR3蛋白属于Ⅰ型跨膜蛋白，由胞外区、跨膜区、胞内区3部分组成；细胞外含有22个LRR，跨膜区由21个氨基酸（705～725）组成，细胞内有TIR结构域（754～896）。Toll样受体是近年来发现的重要的免疫受体，是参与非特异性免疫（天然免疫）的一类重要蛋白质分子，也是连接非特异性免疫和特异性免疫的桥梁。在正常健康的细胞中TLRs具有各种功能，其中包括平衡组织内稳态、调节
细胞凋亡；因此在肿瘤组织中TLRs起关键作用。TLRs通过炎症反应、血管生成和细胞凋亡，逃避机体的免疫识别，导致病毒持续生长，为肿瘤细胞营造有利的环境［6］。
TLR3主要表达于细胞内涵体，可识别病毒dsRNA或聚肌胞苷酸：（1）通过核因子Kb（NF-κB，参与炎症反应的转录因子），诱导NDA的氧化损伤和组织修复反应；（2）在肿瘤血管生成中起重要作用，VEGF由肿瘤细胞分泌，引起免疫抑制；（3）通过识别DAMP和丝裂原活化蛋白激（mitogen-activated protein kinases，MAPK）等信号传导通路，其刺激信号的级联反应导致细胞因子的产生和协同刺激因子的表达，抵御病毒感染［7，8］。
缺乏TLR3表达可增加HPV的持续性感染，因此，HPV逃避免疫细胞监视的途径之一是通过避免TLR3的识别，特别是HPV16亚型，是导致HPV16持续性感染及子宫颈病变的原因［9］。TLR3的缺失，造成HPV持续感染，干扰子宫颈局部的天然免疫，导致子宫颈肿瘤的发生。
HR-HPV持续性感染是子宫颈癌前病变与子宫颈癌的主要致病因素，HR-HPV能通过下调TLR3表达，减少朗罕细胞，降低自然杀伤细胞的活性和组织相容性复合体表达而逃避机体免疫识别，导致病毒持续感染及子宫颈病变。本组应用免疫组化SP法检测TLR3在各组子宫颈组织的表达，TLR3在各组中均有表达，随着CIN级别的增高以及肿瘤的形成阳性率逐渐增加，在CIN各组与子宫颈癌组之间差异有统计学意义；Spearman相关性分析发现TLR3与p16蛋白的表达具有相关性（rs=0.538，P＜0.01）。提示Toll样受体之一的TLR3可能作为识别病毒的配体，在CIN向子宫颈癌转化的过程中起重要作用。
随着病毒学说研究的深入和诊断方法的改进，人们对子宫颈癌的早期诊断认识不断提高，需寻求更为精确的CIN3-早期子宫颈癌的诊断及治疗，避免过度治疗及漏诊；TLR在子宫颈癌中的详细作用机制目前尚未阐明［10］，深入分析其在子宫颈癌中的作用机制及信号传递机理，使TLR有望成为治疗子宫颈癌有价值的潜在靶位，在子宫颈癌的早期确诊及治疗方面具有一定意义。
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