Adv Mat | 光免疫治疗：纳米免疫激活聚合物调节肿瘤微环境

撰文：榴莲不酥

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亮点：

本文应用一种新的响应酸性肿瘤微环境（TME）的智能半导体聚合物纳米免疫调节剂（SPNI），其可以与Toll样受体7（TLR7）激动剂组装，到达肿瘤部位，释放TLR7激动剂以激活树突状细胞（DC）。此外，SPNI在NIR光照射下发挥光动力作用，用于直接根除肿瘤和免疫原性癌细胞死亡。这种新的局部免疫激活增强了全身抗肿瘤免疫反应，导致细胞毒性CD8 T浸润增强，从而抑制肿瘤生长和转移。

2021年12月2日，在Advanced Materials杂志上发表了一篇名为“Tumor-microenvironment activatable polymer nano-immunomodulator for precision cancer photoimmunotherapy”的文章，描述了一种新的智能半导体聚合物纳米免疫调节剂，使癌症纳米医学与免疫疗法相结合，在安全性和有效性方面成为治疗癌症的一种有效方式。通过SPNI与TLR7或SPNI在NIR光照射两部分起到增强全身抗肿瘤免疫反应，抑制肿瘤生长和转移的作用。

利用人体自身的免疫系统来对抗癌症的癌症免疫疗法已经改变了癌症患者的治疗范式，然而其临床实施可能会受到患者反应率和免疫相关不良事件的阻碍，如细胞因子释放综合征、严重的神经毒性和多器官功能障碍。

纳米药物通过改善免疫治疗药物的药代动力学和生物分布特征并增强它们与免疫细胞的相互作用以提供更安全、更有效的癌症免疫治疗的巨大潜力。此外，纳米医学可以在一种制剂中提供多种疗法并与免疫疗法协同作用以设计更有效的抗肿瘤联合疗法。可激活的免疫治疗纳米剂已被设计用于感知和响应TME中的内源性触发因素能够在所需目的地选择性释放有效载荷以获得最佳治疗效果。因此，内源性触发敏感的纳米药物在精确递送免疫治疗剂以可控方式在抗肿瘤免疫方面显示出巨大的潜力。

Kanyi Pu教授团队利用内源性和外源性触发器的优势合成了一种用于酸性TME激活的精密光动力免疫疗法的智能半导体聚合物纳米免疫调节剂（SPNI），该聚合物通过耐酸席夫碱连接剂与Toll样受体7（TLR7）激动剂的偶联，引入R837以触发位于内体膜的TLR7连接以促进DC成熟和促炎细胞因子分泌。在肿瘤部位积累后，SPNI发生水解并限制R837的特异性释放以对肿瘤组织内的酸性环境做出响应。当暴露于近红外光照射时，SPNI发挥光动力效应来介导直接肿瘤消融和ICD的产生。释放的免疫原性因子和肿瘤部位TLR7通路的精确激活通过原位疫苗样功能引发适应性抗肿瘤反应。因此，SPNI介导的NIR光动力癌症免疫疗法可抑制原发性癌症的进展，减少自发性肺转移扩散的同时并产生强大的免疫记忆效应。

图1：用于近红外诱导的癌症光动力免疫治疗的半导体聚合物纳米免疫调节剂示意图

Kanyi Pu教授团队首先进行SPNC的合成，之后通过将4T1癌细胞与SPNC或SPNI孵育24小时来研究SPN的细胞内化，并使用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）成像。在SPN处理的4T1癌细胞的细胞质中可看到来自SPN核心的强NIR荧光信号，表明通过能量依赖性内吞途径在4T1癌细胞中有效地内吞SPN。通过H2DCFDA作为荧光探针检测细胞内ROS的产生水平来研究PDT的体外抗癌活性，光照下的SPN有明显的绿色荧光信号变化，通过流式细胞术分析，其平均荧光强度比未受光照射的组增加约4.6至5.7倍，表明PDT介导大量ROS生成，CLSM图像进一步验证了光照下ROS的生成。SPNC或SPNI对4T1癌细胞的细胞活力在40μg/mL的光照射下降低，表明SPN具有显著的光动力抗癌活性。

为了进一步评估SPN在癌细胞中诱导ICD的能力，该团队测定了包括钙网蛋白和HMGB1在内的关键DAMP的释放或暴露。SPN孵育24小时后，4T1癌细胞在光照射后再培养4小时。有光辐照组的SPNC或SPNI中HMGB1的释放比无光辐照组的SPN高，SPN处理的细胞在光辐射下其钙网蛋白显著上调，同时MFI增加。CLSM结果证明钙网蛋白在SPNC和SPNI处理和光照组的细胞表面上暴露，这进一步验证了由光动力效应介导的癌细胞死亡的免疫原性形式的发生。

图2：体外光动力效应及ICD诱导

研究团队指出SPNI的一个关键设计是对TLR7激动剂特异性激活的酸性环境中的癌症生物标记物的敏感性。通过高效液相色谱分析了SPNI的酸性特异性活化，同时进行了R837的水解速度检测。接下来，研究团队在从C57BL/6小鼠分离的骨源性树突状细胞（BMDC）中研究SPN的细胞摄取，SPN培养24小时后，来自SPN的强NIR荧光信号主要定位于溶酶体室，主要表达TLR7。

确定SPNI中佐剂成分对DC的免疫刺激作用对先天性和适应性免疫系统的激活至关重要。SPNI或SPNC培养24小时后，检测与DC成熟相关的共刺激分子的表达。SPNI治疗组触发了CD80和CD86的上调水平，且CD40的表达与对照组相当。通过PFPR与NaBH₄的还原胺化反应合成了PFPR。然而，SPNI-R和PBS处理组在BMDC上共刺激分子的激活方面没有显著差异，证明SPNI中DC激活的酸性pH触发R837释放。该团队为了探索SPNI的佐剂性和ICD效应是否可以作为一种有效的疫苗，采用了DC癌细胞共培养试验。将接种在上腔中的4T1癌细胞装载SPN24小时并暴露于激光照射下，后将未成熟的BMDC放置在下腔中并再培养24小时，然后使用流式细胞术检测DC成熟状态。在TAAs和死亡的4T1癌细胞释放的DAMP的帮助下，SPNC（ ）组诱导了35.1%的成熟DC，比SPNC（-）组高1.73倍，SPNI（ ）组与57.2%的成熟DC表现出协同作用。结果表明，SPNI介导的光动力免疫疗法可以极大地诱导DC活化，在增强抗肿瘤反应方面具有巨大潜力。

图3：体外DC激活和光动力免疫治疗

研究团队进一步研究了SPNI介导的NIR光动力免疫疗法在体内的治疗。将4T1癌细胞植入小鼠体内以模拟远处的乳腺肿瘤。静脉给药后检查原发肿瘤组织中SPN的累积情况以确定NIR光照的时间点。SPNI组和SPNC组肿瘤组织中SPN的数量没有显著差异，肿瘤组织切片的CLSM图像也验证了在注射后24小时原发肿瘤中SPN的有效富集。在注射SPN后24小时，通过NIR激光照射全身给药治疗制剂进行体内抗肿瘤研究。光疗后每三天监测一次原发肿瘤和远处肿瘤的生长情况，与PBS组相比，使用游离R837或SPN（-）的治疗组稍微延迟了肿瘤生长。SNPC（ ）组虽然能抑制原发肿瘤生长但对远处肿瘤的治疗效果差。值得注意的是，SNPI（ ）组延缓了原发性肿瘤和远处肿瘤的生长。同样，SNPI（ ）组在原发性和远处肿瘤的肿瘤重量减少方面较优。24天后检查肺转移情况，肺切片H&E染色显示SPNI（ ）组无肿瘤转移，肺结节显示SPNI（ ）组结节数量显著减少。各种指标数据证实，SPNI介导的NIR光动力免疫治疗可通过抑制远处肿瘤生长和肺转移延迟原发性肿瘤生长并触发远隔效应。为了验证治疗效果，在光照后取小鼠原发肿瘤，用于评估癌细胞凋亡和ICD，数据表明SPN光动力疗法具有诱导癌细胞凋亡和免疫原性癌细胞死亡的优越能力

图4：体内SPNI介导的光动力免疫治疗

为了阐明不同治疗后免疫反应的潜在机制，在NIR激光照射后第3天，通过流式细胞术评估原发性肿瘤和肿瘤引流淋巴结中的DC激活，与原发性肿瘤中DC激活的结果一致，肿瘤引流淋巴结中成熟DC的比例明显高于所有其他组，最有可能是由于成熟DC从原发性肿瘤迁移而来。促炎细胞因子、肿瘤组织中的细胞毒性、测量肿瘤组织中CD8 T细胞的比例、中央记忆T细胞的研究结果表明SPNI介导的光动力免疫疗法可以作为原位癌疫苗，激发强大的抗肿瘤T细胞免疫，这有助于抑制局部和周围的肿瘤生长。

图5：近红外光动力免疫治疗后的体内免疫反应

综上所述，KanyiPu教授团队提出了一种高效的NIR光动力免疫疗法，它可以消除原发肿瘤，提供远隔效应以防止远处肿瘤生长和肺转移，并触发免疫记忆的建立。除了TLR7激动剂，这种聚合方法可以推广到设计其他癌症激活的纳米药物，通过偶联其他小分子聚合物的免疫调节剂或治疗剂，从而提供了一种有前景的精准联合癌症免疫治疗策略。

教授介绍

Kanyi Pu教授于2000-2004年在华东理工大学获得理学学士学位，2004-2007年在复旦大学获得硕士学位，2007-2011在新加坡国立大学获得博士学位。现就职于新加坡南阳理工大学，研究方向主要是分子影像、纳米医学、分子探针及生物光子学。曾获得2018年Wiley生物科学贡献奖，纳米生物技术青年创新奖。KanyiPu教授是Clarivate Analytics列出的高被引研究员，英国皇家化学会（FRSC）会士，ACSApplied Polymer Materials and Biomaterials Research副主编，NanoResearch Young Star主编。

参考文献

Liu J, He S, Luo Y, et al. Tumor-microenvironmentactivatable polymer nano-immunomodulator for precision cancerphotoimmunotherapy. Adv Mater. 2021, e2106654.