2020年国自然热点—eccDNA的前世今生

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eccDNA为什么火？它到底是何方神圣？

2019年11月，顶尖国际学术期刊《Nature》和《Cell》相继发表了关于染色体外环状DNA(extrachromosomal circular DNA，eccDNA)的重要研究，彻底颠覆了人们对癌基因的传统认知，同时也迅速引爆了整个生物医学界，一时之间，将人们的目光都吸引到这个科研界的新宠儿身上。

大家都知道，DNA位于染色体上，但事实上，染色体外也有DNA，其中有一种特殊的环状DNA，就是今天要跟大家介绍主角--eccDNA。环状DNA是自然界普遍存在的一种DNA分子形式，例如细菌或酵母等微生物的基因组DNA、细菌质粒、线粒体DNA等等都是环状DNA分子。真核生物中还有一类特殊的环状DNA分子，它们从正常基因组中分离或脱落下来，游离于染色体基因组之外，以特殊的方式参与生理或病理过程。由于它们是在染色体之外独立存在的DNA分子，因此统称为染色体外DNA，又常常是环状的，因此称其为染色体外环状DNA，简称eccDNA。它在很多物种中均存在，包括酵母、线虫、果蝇、哺乳动物、植物等等。

其实，这种DNA并不是首次被发现，早在1965年就有关于eccDNA的报道，但当时并没有引起科学界重视，认为它只是染色体外无意义的垃圾碎片。近年来研究表明，eccDNA往往在肿瘤和衰老过程中富集，以特殊的方式参与肿瘤和衰老的发生发展进程。在大部分人类癌症细胞中eccDNA广泛存在，且它的富集通常会促进癌基因的扩增，从而增加了癌基因的可塑性和不稳定性，因此其对肿瘤细胞的进化可能存在重要的意义，这一发现使eccDNA一跃成为科研界的新宠儿。

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eccDNA的主要特征

1.长度特征

目前对eccDNA的大小还没有定论，eccDNA大部分小于25kb，主要分布在0.1-5KB，但不同的文献报道中表述略有差别。它们往往是一些特殊的基因区域形成的，可携带完整的基因和特殊的调控元件，能独立完成复制过程，但不携带着丝粒和端粒结构。

eccDNA的长度分布

2.结构特征

早期对eccDNA结构认识比较局限，主要发现它们是环状DNA分子，并且往往是一些基因扩增的产物，其中也包含着DNA复制起始点，因此可以独立完成复制作用。2019年，Nature以及Cell文章对eccDNA的结构有了较为深刻的探索分析，发现eccDNA不仅携带了完整的基因，还携带了基因上游的启动子和增强子元件。eccDNA的染色质结构更加松散，其中的电镜照片也清楚的显示eccDNA为游离在染色体之外的环状DNA分子。

电镜展示eccDNA的圆环结构

3.形成特征

早期的研究发现eccDNA是基因扩增的产物，是基因组不稳定性的一种表现形式。肿瘤基因扩增往往以两种方式，一种是在染色体上进行基因的扩增，另一种则是形成eccDNA。目前关于肿瘤中eccDNA的形成机制还没有定论。早期的研究认为短重复序列是介导eccDNA形成的因素，主要通过基因重组机制实现，也有一些模型认为是在DNA复制过程中通过loop切除或在DNA复制暂停的时候复制泡中断裂的DNA片段连接形成。2018年，Anindya Dutta等在他们的一篇综述文章中用示意图展示了各种可能形成eccDNA的分子模型。

eccDNA可能的形成机制

4.表达特征

eccDNA可以携带完整的基因，尤其是肿瘤中经常携带致癌的驱动基因，不受控制的表达这些基因，最终导致肿瘤的恶性增长。eccDNA是基因扩增的一种形式，对癌基因的表达增高有重要的贡献。早期的研究聚焦于发现eccDNA的存在，并且是癌基因扩增的重要形式，认为这对癌基因表达的贡献主要是由于基因拷贝数的增加所致。2019年，Nature和Cell文章表明，eccDNA中染色质高度开放，并且其上存在着增强子序列，这些特征都提高了它的转录活性，因此，eccDNA对癌基因的过度表达既有拷贝数增加的因素，更有eccDNA本身高度转录活性的贡献。

eccDNA通过增加拷贝数和提高转录活性增强癌基因扩增

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eccDNA的常见功能

eccDNA作为独立的DNA分子，在细胞中发挥功能的方式和机制是非常重要的问题。目前对eccDNA的功能有一定基础的研究，这里也为大家介绍一下eccDNA常见的功能，但相信随着研究的不断深入，未来一定会有更多新的功能被发现。eccDNA主要功能如下图所示：

eccDNA主要的功能

（1）功能一：驱动肿瘤的异质性和耐药性（Nature 2017）

2017年，Nature报道eccDNA是肿瘤的关键特征，它可以编码多种促进肿瘤发生发展的基因eccDNA在肿瘤细胞发生、肿瘤细胞多样性及耐药性过程中发挥的作用远远大于位于染色体中的相应线性基因发挥的作用，即eccDNA能够驱动肿瘤的异质性和耐药性。

（2）功能二：促进癌基因的活性（Nature 2019）

继eccDNA在肿瘤中的功能探讨，2019年Nature上再次报道了eccDNA的重磅研究成果，该研究发现eccDNA能够通过高度开放染色质和超远距离调控等方式促进癌基因的转录，是一种新型的癌基因。紧随其后，Cell也报道癌基因和其临近的增强子可以通过eccDNA形式进行扩增，从而发挥促癌作用，表明eccDNA在加速肿瘤进化中起着核心作用。

（3）功能三：驱动致癌基因重排（Nature Genetics，2019）

2019年末，Nature Genetics 报道神经母细胞瘤中eccDNA，不仅发现了多种未被发现过的eccDNA，还发现eccDNA是体细胞基因组重排的主要来源，揭示了eccDNA通过嵌合环化和重新整合到线性基因组中的方式，导致致癌基因重组，为eccDNA功能探索提供了新的方向。

（4）功能四: 液体活检及分子标志物（PNAS，2020）

2020年，NIPT之父卢煜明教授在PNAS上发文，发现在孕妇血浆样品中可检测到胎儿eccDNA，可作为新型的非侵入性产前检测分子标志物。鉴于eccDNA优于线性DNA等分子的生物稳定性以及独特的分子结构特征，其作为体液活检标志物具有巨大的优势，暗示我们eccDNA不仅仅在肿瘤发生发展中起着重大作用，也可能是一种极具潜力的肿瘤分子标志物。

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eccDNA如何检测？

eccDNA测序（别名：Circle-Seq﹑环状DNA测序）是eccDNA检测利器，可以高通量地对检测样品中的所有eccDNA，具有检出率高﹑准确性好等优点。云序生物eccDNA测序采用多种方法高效地富集和扩增eccDNA，简述如下：首先，利用离子交换柱高效富集基因组DNA中的eccDNA,然后利用核酸酶进一步对富集的eccDNA进行消化除去残余线性DNA。富集纯化后，通过滚环扩增获得大量的eccDNA拷贝,再利用NGS测序高通量地检测样品中所有的环状DNA分子。严谨的实验流程，极大地提高了eccDNA的检出率和检测灵敏度。最后，通过严谨的eccDNA生信流程，实现了对eccDNA准确的识别和详细的基因注释,快速找到癌症、肿瘤等疾病机理研究和诊断的靶向eccDNA。

       

云序生物eccDNA测序实验示意图

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云序生物eccDNA测序优势

1.国内首推eccDNA测序服务

云序生物是国内最早提供eccDNA测序服务的公司，云序在2018年已启动了eccDNA测序技术的开发。迄今为止，我们已经完成上千例样品的eccDNA测序，积累了丰富的项目经验，样品类型涵盖：组织﹑细胞﹑血清﹑血浆﹑尿液等，物种涵盖：人﹑小鼠﹑大鼠﹑拟南芥﹑果蝇﹑酵母﹑非洲爪蟾等。

云序eccDNA测序数据质控：

2.唯一提供eccDNA一站式服务的公司

云序是唯一一家提供eccDNA检测和鉴定一站式服务的公司，除了eccDNA测序，云序还可以提供包括eccDNA Outward PCR和Sanger测序在内的一系列eccDNA验证服务。

√ 云序产品1：eccDNA测序

作用：通过NGS测序高通量地检测和识别样品中的所有eccDNA。

√ 云序产品2：eccDNA Outward PCR验证

作用：通过核酸外切酶处理和Outward PCR验证eccDNA的环形结构。

√ 云序产品3：eccDNA Sanger测序

作用：通过金标准的Sanger测序，验证eccDNA特异性的junction位点。

3.专业的生信分析

云序生物对eccDNA进行专业细致的注释，提供eccDNA的染色体信息﹑坐标信息﹑长度信息﹑反式剪切位点信息﹑序列信息﹑对应的基因信息﹑基因的GO条目及KEGG信号通路注释信息等，为后续的研究提供了重要线索和便利。

云序eccDNA生信示例：

1）eccDNA表达和差异分析

eccDNA表达注释 （例子）

2）eccDNA整体统计

Venn图                        长度分布                       染色体分布

  

3）eccDNA功能预测

差异eccDNA的GO和KEGG信号通路分析

高质量的数据

云序生物严谨的实验流程和专业的数据分析保证了高质量的结果，eccDNA测序数据与Sanger验证结果完美吻合，实测数据示例如下：

eccDNA测序结果验证