利用癌细胞与正常细胞之间存在的差异，尽可能地杀死癌细胞而降低对正常细胞的影响，仍是目前开发癌症疗法的主要策略。
比如，目前仍在广泛使用的化疗，主要利用癌细胞增殖旺盛的特点；CAR-T细胞疗法利用癌细胞表面存在特异抗原的特点，通过改造T细胞使其能更好的识别癌细胞[1]；靶向治疗药物主要通过识别癌细胞中特异存在的靶向分子来实现精准的治疗[2]。
然而这些方法往往存在杀伤力不足（无法有效杀伤肿瘤细胞）或特异性不强（对正常细胞存在影响）等缺点，因此开发新的治疗靶点及提高靶点杀伤的有效性仍为现在开发癌症疗法的主要方向。
最近，韩国基础科学研究所（IBS）基因组完整性研究中心（CGI）的研究人员在《美国科学院院报》上发表了一项重要研究成果，该团队开发了一种名为CINDELA（Cancer-specific INDEL Attacker）的新型肿瘤疗法，该方法可以通过CRISPR-Cas9靶向癌症特异性插入或缺失（insertions and deletions, InDel）突变，导致多处发生DNA双链断裂，从而实现对肿瘤细胞的特异性杀伤[3]。
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基因组的不稳定性是癌症的主要特征之一，泛癌的全基因组分析表明，除了常见的单核苷酸突变外，大多数癌细胞内还具有相邻正常细胞中不存在的InDel突变，最近的一项研究对2658个完整的癌症基因组进行了分析，结果表明，大多数肿瘤组织含有100到1000个InDel[4]，这些事实都表明InDel可能具有作为肿瘤免疫治疗靶点的潜力。
CRISPR是一种广泛存在于细菌中的天然免疫系统，其可以诱导噬菌体来源的DNA上的特定序列发生双链断裂（Double strand break, DSB），从而使细菌免于噬菌体的侵染。经改造，目前CRISPR技术已成为对多种生物细胞进行精准基因编辑的有效工具。DSB在多种生物细胞中均被视为是严重的DNA损伤类型，一定数量的DSB会影响细胞的生长甚至导致细胞死亡。
肿瘤细胞中存在特异的DNA片段（InDel位点），而CRISPR-Cas9系统可精准靶向这些片段并产生DSB，那么，是否可以通过CRISPR-Cas9靶向并切断肿瘤特异InDel位点，从而杀伤肿瘤细胞且不影响正常细胞呢，基于这一想法，研究人员们成功开发了名为CINDELA的新型肿瘤疗法。
机制图
首先，研究人员对DSB诱导细胞杀伤的过程进行了验证。
ER-AsiSI U2OS细胞可表达AsiSI限制酶，该酶在三苯氧胺（4OHT）的作用下会移动到细胞核中，并对其靶向序列进行切割产生DSB。对照当前版本人类基因组（GRCh38）可知该酶有1225个酶切位点，考虑到DNA甲基化对酶切位点的保护，最终大约有10% 到20% ，也就是100到200个位点可被AsiSI酶识别并切割。
研究人员使用4OHT处理细胞，结果表明，与未使用4OHT处理的细胞相比，几乎所有ER-AsiSI U2OS细胞都死亡，DNA发生DSB的标志物γ-H2AX以及凋亡细胞检测的结果也印证了这一事实。
4-OHT存在下，AsiSI限制酶能切割基因组DNA产生大量DSB位点并诱导细胞凋亡
现在，我们知道酶诱导产生的大量位点的DSB确实可以有效杀伤增殖的癌细胞，那么CRISPR-Cas9切割产生的DSB是否也能产生类似效果呢？
在这里，研究人员选择了一些经典的CRISPR-Cas9靶向序列，这些序列在人类基因组中重复出现，靶向范围从单个位点到20000个位点不等。研究结果表明，当合成的向导RNA（guide RNA, gRNA）靶点数量增加到10个以上时（大约产生20个DSB），人类胚胎肾细胞（HEK293T）开始死亡，且随着sgRNA靶向位点的增加，HEK293T细胞的死亡也进一步增加。随后，这些结果也在其他类型的一些肿瘤细胞（HCT-116、MDA-MB-231、K562）中得到了重复。
CRISPR-Cas9靶向特异位点产生的DSB可有效杀伤肿瘤细胞且杀伤效果与靶点数呈正相关
为了验证CINDELA方法的可行性，研究人员进行了进一步的实验。通过对骨肉瘤细胞（U2OS）和结直肠癌细胞（HCT-116）进行全基因组测序，并使用RPE1（一种永生化的视网膜上皮细胞）细胞作为正常细胞对照，研究人员鉴定出一系列肿瘤细胞特异性的InDel。之后通过设计靶向InDel的sgRNA，研究人员证实CINDELA确实可以通过靶向特异性InDel并诱导其产生DSB的方式有效杀伤肿瘤细胞，且杀伤效果依赖于靶向位点的数量。
使用CRISPR-Cas9靶向肿瘤细胞特异性InDel位点，可有效杀伤肿瘤细胞
为了验证CINDELA疗法是否可以应用于患者来源的肿瘤样本，研究人员使用了来自脑胶质瘤患者的原代肿瘤细胞系GBL-67，基于全基因组测序的结果，设计了26个针对GBL-67特异性InDel的gRNA（产生50个DSB），结果发现CINDELA处理的GBL-67细胞发生大量凋亡，而作为对照的NSC-10细胞（神经干细胞，无靶向InDel）在相同处理后没有表现出任何生长抑制。
CINDELA疗法对患者来源的原代肿瘤细胞系作用显著
除了体外实验，研究人员还进行了动物试验以验证CINDELA疗法对体内肿瘤的功效。在这里，研究人员将HCT-116细胞异种移植到小鼠体内，并使用以多个基因组位点为靶点（multiple loci，MT）或以23个HCT-116特异性InDel为靶点(HCT-116-specific 23 InDels，HMIX23)的sgRNA进行处理，结果发现CINDELA治疗明显抑制了肿瘤的生长，且与MT2（靶向两个基因组位点）相比，MT50（靶向50个基因组位点）或HMIX23对肿瘤的抑制效果更加显著。
此外，治疗期间，小鼠未表现出任何明显不良反应，说明CINDELA疗法不会影响小鼠的正常组织或细胞。
CINDELA疗法可抑制小鼠体内异种移植肿瘤的生长
总的来说，本文介绍了一种使用CRISPR-Cas9靶向肿瘤特异InDel的新型癌症疗法，这种疗法巧妙结合肿瘤中存在特异性InDel突变的特点，以及CRISPR-Cas9对靶向位点精准切割的能力，产生了一种适用于大多数肿瘤类型的普适性癌症治疗新策略，为癌症患者提供个体化和精准治疗的同时，没有明显的副作用。
值得一提的是，如何实现CINDELA试剂在肿瘤内部的有效递送目前仍是一个具有挑战性的问题，新的更加有效的递送系统必将使CINDELA疗法更加完善，未来期待这一疗法的进一步改进和临床实验能为广大癌症患者带来更多的惊喜。
参考文献：
1. Kochenderfer JN, Wilson WH, Janik JE, et al. Eradication of B-lineage cells and regression of lymphoma in a patient treated with autologous T cells genetically engineered to recognize CD19. Blood. 2010;116(20):4099-4102. doi:10.1182/blood-2010-04-281931
2. Sawyers CL. Herceptin: A First Assault on Oncogenes that Launched a Revolution. Cell. 2019;179(1):8-12. doi:10.1016/j.cell.2019.08.027
3. Kwon T, Ra JS, Lee S, et al. Precision targeting tumor cells using cancer-specific InDel mutations with CRISPR-Cas9. Proc Natl Acad Sci U S A. 2022;119(9):e2103532119. doi:10.1073/pnas.2103532119
4. ICGC/TCGA Pan-Cancer Analysis of Whole Genomes Consortium. Pan-cancer analysis of whole genomes. Nature. 2020;578(7793):82-93. doi:10.1038/s41586-020-1969-6
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