雷帕霉素（Rapamycin）是细菌产生的次级代谢产物，最初被确定为抗真菌剂，后来发现它具有免疫抑制和抗癌活性。这一特性引起了科学家们极大的兴趣，开启了对Rapamycin靶点的探索。雷帕霉素靶蛋白（Target of rapamycin, TOR）是一种高度保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，最找在酵母中被描述，随后是哺乳动物细胞。该领域的第二个里程碑是在20世纪90年代后期意识到TOR在调节细胞生长和新陈代谢中起核心作用。第三个里程碑是在21世纪初发现TOR存在于两个结构和功能不同的复合物中（TORC1和TORC2），从酵母到人类都非常保守。多年来的研究显示，mTOR（mammalian TOR）失调与多种重大疾病相关，例如糖尿病、癌症和神经系统疾病等。鉴于mTOR在基础生物学和医学中的重要性，它的研究已经成为一个庞大而复杂的研究领域。
2022年5月12日，来自瑞士巴塞尔大学的Michael N. Hall团队（拉斯克奖得主）在Cell杂志上发表了题为mTOR substrate phosphorylation in growth control的综述性文章。作者以哺乳动物TOR（mTOR）为重点，全面性地总结回顾了所有已报道的mTOR直接磷酸化底物，并根据近期的结构信息，探讨了mTORC1和mTORC2在具有相同催化亚基的情况下，如何选择和磷酸化不同的底物。
1. mTORC1和mTORC2
mTOR是磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol, PI）激酶相关激酶（PIKK）家族的非典型蛋白激酶的成员。尽管与PI激酶有共同的祖先，mTOR和其他PIKKs没有已知的脂质激酶活性，反而具有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性。mTOR的N末端包含多个HEAT重复序列，中间部分是FRAP/ATM /TRRAP（FAT）结构域，然后是FKBP-rapamycin binding（FRB）结构域，C端包含激酶结构域（图1）。
mTOR核化形成两个功能和结构不同的复合物，mTORC1和mTORC2。mTORC1包括mTOR、mLST8和RAPTOR（图1）。mTORC1是由mTOR-mLST8-RAPTOR异源三聚体构成的二聚体。RAPTOR负责识别部分mTORC1底物，并将mTORC1靶向溶酶体表面。mTORC2是异源四聚体的二聚体，包括mTOR、mLST8、RICTOR和mSIN1（图1）。mSIN1通过其N端嵌入到RICTOR中，然后围绕mLST8折叠。mSIN1的中间保守区域（CRIM）对于mTORC2底物的招募非常重要。mSIN1 C端PH结构域是mTORC2在膜上定位所必需的。
mLST8 是两种复合物的共同点，靠近mTOR的激酶位点结合（图1）。与RICTOR一样，mLST8敲除后胚胎在第10.5天死亡，而mTOR或RAPTOR敲除后胚胎在第3.5天死亡，表明mLST8可能对mTORC1功能并不重要。mLST8敲除的MEFs保留了磷酸化mTORC1底物S6K1和4E-BP1的能力，但不能磷酸化mTORC2底物AKT和PKCa。mLST8通过与mSIN1和mTOR的直接相互作用稳定mTORC2。此外，mTORC2的冷冻电镜结构显示，mLST8与mSIN1相互作用以定位mSIN1底物相互作用的CRIM结构域。mLST8在mTORC1中没有相同的功能。
图1. mTOR和部分底物示意图
2. 上游调控
mTORC1整合营养物质、生长因子和能量输入，促进合成代谢和细胞生长，同时抑制分解代谢（图2）。mTORC1通过小GTPases RAG-A、RAG-B、RAG-C和RAG-D感知营养可用性。RAGs形成异源二聚体，其活性构象是RAG-A/RAG-BGTP和RAG-C/RAG-DGDP。这种构象将mTORC1招募到溶酶体中，并被小GTPase RHEB激活。RAGs与溶酶体表面的调节因子（由LAMTOR 1-5组成的五聚体复合物）结合。RAG-C/RAG-D由具有GAP活性的folliculin复合物（包括FLCN和FNIP1/FNIP2）激活。将RAG-A/B上游抑制剂GATOR1抑制后可激活RAG-A/B。GATOR1被GATOR2抑制，GATOR2是五种蛋白组成的复合物，由氨基酸传感器SESTRIN2和CASTOR1进行负调控。最近，SAR1B被报道与SESTRIN2在leucine感知和GATOR2调控中协同作用（Nature | 刘颖课题组报道SAR1B感知细胞内亮氨酸浓度调控mTORC1活性）。GATOR1的另一个相互作用伙伴是KICSTOR。KICSTOR将GATOR1锚定在溶酶体上，最终抑制RAG-A/B和mTORC1。此外，mTORC1上游的SAM传感器SAMTOR，通过SAM间接感知methionine的可用性。谷氨酸分解产生的a-酮戊二酸也通过促进RAG-B GTP loading并因此促进mTORC1定位到溶酶体来调节RAG活性。
生长因子通过PI3K-AKT-TSC活化mTORC1。酪氨酸激酶受体受到细胞表面胰岛素或其他生长因子的刺激后，活化PI3K。PI3K将PIP2转化为PIP3。PDK1在细胞质膜中与PIP3结合，并通过磷酸化AKT-Thr308激活AKT。活化的AKT磷酸化并抑制TSC复合物（包括TSC1、TSC2和TBC1D7）。TSC复合物是小GTPase RHEB的GAP。GTP-bound RHEB通过结合mTOR中的两个HEAT repeats和FAT结构域来变构激活mTORC1。因此，PI3K-AKT依赖性TSC复合物抑制通过将RHEB锁定在其活化的GTP-bound状态来激活mTORC1。
能量应激通过AMPK抑制mTORC1。低ATP产生引起细胞内AMP:ATP和ADP:ATP比率升高，从而导致AMPK的变构激活。反过来，AMPK通过促进葡萄糖摄取和增加b-oxidation来恢复ATP的产生。AMPK还通过磷酸化ULK1来激活自噬。因此，AMPK和mTORC1是相互拮抗的。AMPK在能量应激下以两种不同的方式抑制 mTORC1：（1）AMPK磷酸化TSC2的Thr1271和Ser1387以激活TSC复合物针对RHEB的GAP活性，从而阻止mTORC1活化；（2）AMPK直接磷酸化RAPTOR的Ser722和Ser792位点以抑制mTORC1。相反，mTORC1直接磷酸化AMPK的催化亚基a1（Ser347）或a2（Ser345和Ser377），从而减少AMPK活化环中的Thr172磷酸化，进而限制AMPK活性。有趣的是，AMPK在mTORC2和RICTOR的多个位点特异性磷酸化mTOR（Ser1261），以增加独立于mTORC1负反馈回路的mTORC2活性。有人提出，AMPK依赖性mTORC2活化的目的是激活抗凋亡AKT信号传导，以促进急性能量应激期间的细胞存活。
图2. mTOR信号通路
mTORC2通过PI3K被生长因子激活。mTORC2的核心成分mSIN1包含一个PH结构域，该结构域结合mTOR进而自抑制 mTORC2。激活PI3K后，mSIN1 PH结构域会结合新生成的PIP3，从而释放mTOR激活mTORC2。PIP3-bound PH结构域还可以将mTORC2招募到质膜中，在那里它可以磷酸化膜结合底物，如AKT。PI3K还促进mTORC2与核糖体的关联，这是mTORC2激活所必需的。一旦被激活，mTORC2磷酸化AKT Ser473以完全激活AKT。mTORC2活性也可以通过来自mTORC1的负反馈回路进行调节。mTORC1及其直接效应子S6K在不同部位磷酸化IRS1以抑制胰岛素信号传导。mTORC1还直接磷酸化并激活GRB10。因此，mTORC1下调PI3K信号通路以抑制mTORC2活性。S6K还分别磷酸化RICRTOR和mSIN1的Thr1135和Thr86/Thr398，以破坏mTORC2的稳定性。mTORC2 的细胞定位比 mTORC1 更多样化。据报道，mTORC2与质膜、核糖体、线粒体、高尔基体、内体、内质网以及线粒体相关内质网膜有关。mTORC2如何在这些不同的位站点被激活，目前还知之甚少。
3. mTOR抑制
Rapamycin
mTOR被rapamycin及其同源类似物（称为rapalogs）抑制。Rapamycin与内源蛋白FKBP形成复合物，该复合物结合并抑制mTOR。FKBP-rapamycin与催化裂隙相邻的mTOR中的FRB结构域结合，从而在空间上阻碍底物进入催化位点。虽然mTORC1对rapamycin非常敏感，但mTORC2不敏感。RICTOR部分覆盖了mTOR的FRB结构域。因此，RICTOR在mTORC2中屏蔽mTOR FRB结构域，进而阻止FKBP-rapamycin结合。然而，长期rapamycin处理可以间接抑制mTORC2。Rapalogs是rapamycin衍生物。它们的作用方式与rapamycin相同，但具有改进的药物样特性。它们在临床上用于免疫抑制和对抗癌症。已经开发出ATP竞争性mTOR活性位点抑制剂，可有效抑制mTORC1和mTORC2。然而，迄今为止尚未批准用于临床的活性位点抑制剂。
DEPTOR
mTORC1和mTORC2具有相同的内源性抑制剂DEPTOR。最近的两项研究表明，DEPTOR以变构方式调节mTOR。DEPTOR也是mTOR的底物。截短的mTOR直接磷酸化DEPTOR，导致其被蛋白酶体降解。通常认为DEPTOR被mTORC1和mTORC2磷酸化，但这仍有待证明。在高浓度下，DEPTOR通过PDZ和DEPt结构域之间的连接区域以单独的底物样模式与mTOR FRB结构域结合。有趣的是，DEPTOR缺失仅增加mTORC1活性，而DEPTOR过表达促进mTORC2活性。DEPTOR对mTORC2的这种矛盾效应可能是由于抑制了mTORC1负反馈回路。
PRAS40
mTORC1具有特定的内源性抑制剂PRAS40。PRAS40含有一个TOS motif，该motif也存在于部分mTORC1底物中。RAPTOR结合TOS motif将底物招募到mTORC1。PRAS40与其他底物竞争结合mTORC1，从而抑制下游信号传导。AKT磷酸化PRAS40 Thr246，其诱导自己从mTORC1释放并被胞质14-3-3蛋白隔离。mTORC1还磷酸化PRAS40 Ser183、Ser212和Ser221，以诱导PRAS40从mTORC1中释放。
4. mTORC1底物：S6K、4E-BP、ULK1和TFEB
目前描述最完善mTOR底物是S6K和4E-BP。它们被广泛用作mTORC1活性指标，因为存在特异性识别这两种蛋白质磷酸化形式的抗体。
S6K
哺乳动物中有两个S6K，由不同的基因编码。S6K属于AGC激酶家族。AGC激酶家族成员通常是mTORC2的底物。S6K是唯一的AGC激酶，是一个mTORC1底物。S6K1被mTORC1和PDK1磷酸化并激活。mTORC1磷酸化S6K中linker区域HM中的Thr389，PDK1磷酸化S6K激酶结构域T-loop中的Ser229，两个位点的磷酸化对S6K1的完全激活是必要的。S6K1有一个自我抑制性C端，在mitogen刺激时通过Ser411、Ser418、Ser421和Ser424位点的磷酸化释放。自抑制结构域的释放使S6K结构松弛，允许其被mTORC1和PDK1磷酸化。mTORC1还磷酸化S6K TM中的Ser371，其对S6K1活性也是必不可少的，然而，很少有实验来阐明其具体功能。S6K具有一个TOS motif，是mTORC1识别和磷酸化所必需的。
4E-BP
哺乳动物中有三种4E-BP亚型，每种亚型由不同的基因编码。三者都受mTORC1调控。在未磷酸化状态下，4E-BP结合并抑制eIF4E以阻止翻译起始。4E-BP依次被mTORC1磷酸化，Thr37/Thr46的磷酸化使4E-BP-eIF4E结合亲和力降低100倍，随后Ser65/Thr70的磷酸化使亲和力再降低40倍。这释放了4E-BP，允许eIF4E结合eIF4G并启动翻译。最近的一项研究阐明了mTORC1如何识别4E-BP并以分层方式对其进行磷酸化。mTORC1通过RAPTOR结合4E-BP的TOS和RAIP motif（Arg-Ala-Ile-Pro，仅在4E-BP中发现）。RAPTOR对这些motif的结合使4E-BP的磷酸化位点朝向mTORC1活性位点。eIF4E覆盖了Ser65和Thr70位点，防止它们在没有Thr37/Thr46先前磷酸化的情况下被磷酸化。有趣的是，Thr37/Thr46的磷酸化对rapamycin是不敏感的，而Ser65/Thr70的磷酸化对rapamycin敏感。
ULK1
ULK1与ATG13和FIP200形成复合物启动自噬。该步骤由对立的激酶mTORC1和AMPK反向控制。在营养丰富的条件下，mTORC1与ULK复合物相互作用，并磷酸化ULK1 Ser757和ATG13 Ser259，从而抑制复合物最终阻断自噬。相反，在营养贫乏的条件下，AMPK会磷酸化并激活ULK1和ATG13，同时抑制mTORC1促进自噬。一旦被激活，ULK1还通过抑制mTORC1促进自噬，通过RAPTOR在多个位点的磷酸化，阻碍底物与RAPTOR的相互作用。
TFEB
TFEB和TFE3是同源helix-loop-helix亮氨酸拉链转录因子，可调节参与溶酶体生物发生、自噬和脂质代谢。TFEB和TFE3在饥饿时转移到细胞核中激活靶基因。在营养充足时，它们被mTORC1磷酸化，因此被14-3-3蛋白滞留在细胞质中。TFEB和TFE3均不包含TOS基序，通过与GDP-bound RAG-C/RAG-D相互作用被招募到mTORC1。mTORC1磷酸化TFEB的Ser122、Ser142和Ser211。Ser211磷酸化介导14-3-3结合和细胞质隔离。TFEB-Ser142或Ser211向丙氨酸的突变导致转录因子的组成性核定位。此外，除了控制TFEB定位外，Ser142和Ser211磷酸化诱导STUB1介导的TFEB泛素化和降解。
5. mTORC2的底物：AKT、PKC和SGK
mTORC2底物AKT、PKC以及SGK都属于AGC激酶家族。它们具有相似的结构，其特征在于N末端调节结构域和由激酶结构域和C-tail组成的C末端催化区域。AKT、PKC和SGK中的关键磷酸化位点位于激酶结构域中的T-loop和C-tail中的TM和HM（hydrophobic motif）。PDK1对T-loop的初始磷酸化响应PI3K的上游刺激，然后通过mTORC2磷酸化HM。在没有PDK1和T-loop磷酸化的情况下，mTORC2仍然可以磷酸化AKT中的HM。此外，与其他AGC激酶不同，AKT还含有一个N端PH结构域，在没有PIP3的情况下具有抑制作用。因此，PIP3依赖的膜定位也是AKT中T-loop (Thr308)和HM (Ser473) 磷酸化的先决条件。
TM磷酸化与T-loop和HM磷酸化明显不同。在AKT和PKCa中，TM位点被mTORC2共翻译磷酸化。这种磷酸化是组成性的，独立于上游输入，并且是激酶稳定性所必需的。在AKT和PKC中，T-loop和HM的磷酸化决定了激酶的活性，而TM的磷酸化决定了蛋白的稳定性。在AKT中，催化活性需要T-loop磷酸化，而HM磷酸化则需要获得最大的AKT活性。关于SGK磷酸化作用的信息较少，SGK T-loop（Thr256）被PDK1磷酸化，HM（Ser422）被mTORC2磷酸化。SGK TM 激酶尚未被鉴定，但TM磷酸化对生长因子敏感，是完全激酶活性所必需的。
最近，提出了一种新模型，挑战AGC激酶中HM磷酸化的传统观点。Baffi等人鉴定了一个进化上保守的motif F-X-X-X-F-T（F=苯丙氨酸，X=任意氨基酸，T=磷酸受体苏氨酸），称为TOR相互作用基序（TOR interaction motif, TIM）。TIM是TM的N端，被mTORC2磷酸化。与传统观点相反，Baffi等人提出AKT1和PKCbII中的HM磷酸化不是由mTORC2引起的，而是AKT和PKCbII自我磷酸化。在这个模型中，mTORC2磷酸化TIM，反过来促进PDK1磷酸化T-loop，然后AKT1和PKCbII对HM进行自我磷酸化。
6. 对所有mTORC1和mTORC2底物进行全面考察
mTORC1
绝大多数底物缺乏TOS、RAIP或任何其他motif。缺乏已知识别基序的底物可能以一种特殊的方式结合mTORC1。解决这种motif-free的相互作用可能需要结构分析和对接模拟。根据功能进行分组，这些底物可以聚类为翻译、自噬和转录。通过4E-BP进行的翻译调控是最早描述的mTOR信号传导的作用之一。其他翻译或调节因子（例如eIF2B、eIF4E、eEF2K和S6K）的直接mTORC1磷酸化可能是内置的功能冗余，以确保对mTOR信号传导的中心功能进行防故障调节。类似的推理可以应用于各种自噬因子（例如AMBRA1、ATG13、ATG14、DAP1、NRBF2、PACER、TRPML1、ULK1和WIPI2），它们是mTORC1的直接靶标。对于这些自噬因子，mTORC1磷酸化的结果始终朝着抑制自噬的方向发展。mTORC1还磷酸化和调节信号传导（例如AMPK、IRS1和GRB10）和代谢途径（例如LIPIN1和CRTC2）的成分。
mTORC2
mTORC2已鉴定的底物比mTORC1少。大多数确定的mTORC2靶蛋白都归属于AGC激酶家族（例如AKT、PKC和SGK）。mTORC2中Ser2481的mTOR自我磷酸化在脊椎动物中是保守的，但其意义尚不清楚。AMOTL2、MST1和YAP属于控制器官大小的Hippo通路。在少数描述的mTORC2底物中存在三种Hippo成分，这高度暗示了通路之间的串扰。与mTORC1位点相比，mTORC2位点的丝氨酸（27个位点）与苏氨酸（20个位点）磷酸受体残基的比例较低。据报道IGF1R和INS-R在2个酪氨酸残基上被磷酸化。
7. mTOR靶蛋白磷酸化MOTIF: S/T-P
作者在56个mTORC1和26个mTORC2底物中分别发现了104个和51个磷酸化位点。基于这些体内底物，为mTORC1和mTORC2构建了共同的识别磷酸化基序。与苏氨酸（23%）相比，mTOR靶位点更倾向于将丝氨酸（77%）作为磷酸受体残基。重要的是，mTOR靶位点主要包含位于位置 1的脯氨酸。亮氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和谷氨酰胺也在这个位置上受到青睐。磷酸化反应可能涉及特定的构象适应或超出直接激酶-底物相互作用的其他作用，例如翻译后修饰。值得注意的是，在考虑所有底物时，对位置-1的任何氨基酸没有偏好。然而，当仅关注AGC激酶作为底物时，苯丙氨酸和亮氨酸在此位置占主导地位。
2011年的一项研究，基于肽库的体外磷酸化，提出了一种mTOR共同磷酸化基序。推测的基序由磷酸化的丝氨酸或苏氨酸组成，然后在 1位置以脯氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、色氨酸、酪氨酸或缬氨酸按优先顺序递减。因此，除S/T-P以外的任何序列在鉴定推定的mTOR位点方面都有限。
8. mTOR底物识别:TOS和RAIP motif
mTORC1和mTORC2磷酸化不同的底物，尽管它们具有相同的催化亚基。这是矛盾的，因为mTORC1和mTORC2中的激酶口袋在结构上是相似的，并且完全包含在mTOR中，与相邻亚基没有显著的相互作用。此外，没有检测到mTORC1或mTORC2特异性磷酸化基序。解释mTORC1和mTORC2磷酸化不同底物的机制可能涉及每个mTOR复合物特有的亚基。有证据表明，每个复合物所独有的亚基结合底物，以呈现到一个共同的催化位点。
在mTORC1中，RAPTOR结合TOS基序（F-X-F-(E/D)-F，F代表hydrophobic residue, X代表任意残基）。RAPTOR中的TOS结合位点与mTOR中的激酶位点之间的距离约为65 A˚，表明在TOS基序和底物中的目标磷酸化位点之间需要至少20个氨基酸的间隔。TOS基序首先在S6K和4E-BP中鉴定，随后在其他mTORC1底物中鉴定出来。此外，4E-BP还具有RAIP基序，可与TOS基序协同作用，以加强4E-BP与RAPTOR的相互作用。其他RAPTOR结合基序也已被报道，例如IRS1中的SHC和IRS1 NPXY（SAIN）结构域以及eIF4E、ULK1、LARP1和DAP1中的S/P-X-P-X-P-P基序。此外，一些底物可以以不依赖于RAPTOR的方式与mTORC1相互作用。最后，mTOR中的FRB结构域被认为是次级底物结合位点，可以在mTORC1的S6K招募中与RAPTOR TOS结合位点合作作用。在mTORC2中，有证据表明mSIN1中的CRIM结构域负责底物招募。CRIM 结构域高度灵活，与mLST8和mTOR激酶位点相邻。mTORC2底物中是否存在一个序列基序，相当于TOS或RAIP基序，由CRIM结构域识别仍有待确定。
结论与展望
mTOR能够通过调节4E-BP和S6K等靶点发挥广泛的作用，并通过它调节多种蛋白质的水平。此外，mTOR控制许多转录因子的水平和活性，从而控制基因的表达。因此，仅对少数mTOR靶标进行直接磷酸化就足以产生广泛的影响。尽管进行了三十年的积极研究，但仍有许多问题有待确定，例如大多数底物如何被识别并被招募到mTORC1或mTORC2中尚不清楚，TOR复合物的细胞内定位仍然是个极大的挑战。
磷酸化蛋白被磷酸酶主动去磷酸化。因此，磷酸化蛋白的活性以及最终的信号通路由激酶和磷酸酶的平衡控制。然而，磷酸酶在数量上明显少于激酶，因此特异性较低。这种有限的特异性阻碍了磷酸酶研究的进展。磷酸酶参与mTOR信号传导的早期迹象是观察到PP2A在mTOR失活的条件下与S6K结合。mTOR磷酸化PP2A，使其失活，以防止S6K去磷酸化。PP2A去磷酸化MAP4K3，这是氨基酸刺激所需的上游mTORC1调节因子。PP2A还结合RAPTOR使Treg细胞中的mTORC1失活。因此，mTOR和PP2A之间存在功能相互作用，那么mTOR是否与其他磷酸酶也存在相互作用，是未来研究中值得探讨的问题。
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