蛋白磷酸化作为翻译后修饰（post-translational modification，PTM）参与多种生物过程，其调控失衡与多种人类疾病相关。通过质谱方法研究人类完整的磷酸化图谱目前仍然是一个问题。一项对单细胞系的深入研究鉴定出超过50000个磷酸肽，意味着75%的蛋白质组可能被磷酸化【1】。而在PhosphoSitePlus（PSP）等数据库中已经鉴定出超过2000000个磷酸化位点【2】。虽然鉴定磷酸化的完整图谱仍然面临挑战，但鉴定磷酸化的功能特征正在成为磷酸化研究的瓶颈。由于磷酸化的保守性较差，有观点认为并非所有的磷酸化都与适应性、健康相关。所以，采取优先化策略对促进高度相关磷酸化位点的发现至关重要。目前存在的方法有：鉴定高度保守、位于作用界面或具有强调控作用的磷酸化位点，或者兼具这些特征的磷酸化位点【3】。突变实验可以用来表征相关的磷酸化修饰，但不能大规模应用于人类磷酸化研究。我们需要新的研究方法实现对蛋白磷酸化功能的大规模分析。2019年12月9日，来自英国的Pedro Beltrao和David Ochoa在Nature Biotechnology杂志上发表文章The functional landscape of the human phosphoproteome，创建了参考磷酸化蛋白质组图谱和功能图谱。研究者从104种不同的人类细胞类型或组织中人工收集112个富含磷酸化的蛋白质数据集，并重新分析6801个蛋白质组学实验，建立出质量控制标准，创建了一个含有119809个人类磷酸化位点的参考磷酸化蛋白质组图谱。利用机器学习对59个蛋白质组、结构相关、调控相关、进化等相关的特征进行整合分析，得到综合性的功能评分，以此建立出磷酸化蛋白的功能图谱，并鉴定出不同分子机制、生理过程和疾病中的调节性磷酸化位点。为了创建一个质谱（MS）为基础的人类蛋白磷酸化组图谱，研究人员从PRIDE数据库中收集了104种不同的人类细胞类型或组织的112个富含磷酸化的蛋白质数据集，并重新分析6801个蛋白质组学实验，建立出质量控制标准，筛选出119809个具有可信度的磷酸化位点。所分析的样本来源具有异质性，有助于在从健康组织到肿瘤组织等多种组织中鉴定蛋白的磷酸化位点，并识别组织特异性磷酸化位点。虽然丰度更高的蛋白鉴定出磷酸化的位点的可能性越高，但其趋势分布与样本中未修饰的肽段丰度类似。样品种类对磷酸化位点的鉴定没有显著的影响，去除5种最常研究的细胞类型，83%的磷酸化位点仍然保留。将鉴定出的蛋白磷酸化组与PSP数据库中利用质谱识别的221236个人类磷酸化位点进行比较，其中73973个文章中鉴定出的磷酸化位点被5个及以上的MS/MS数据证实，47448个磷酸化位点在PSP中有同等的数据证实。研究人员已经建立了全面的高置信度人类蛋白磷酸化组后，对每个磷酸化位点的一系列特征进行机器学习，得出一个表征适应度的分数——磷酸化位点功能分数。纳入计算的特征包含MS证据（如光谱计数、定位概率）、磷酸化位点调控（包括何种条件下位点被调控及匹配的激酶模体）、结构环境（如在作用界面和表面的可接近性）、进化保守型等4大类59小项。例如，MAF1蛋白参与mTORC1信号通路，其65-80位氨基酸上具有5个可能的磷酸化位点，而S68和S75处的磷酸化已经证明抑制MAF1 RNA聚合酶III的抑制功能，且具有较高的光谱计数、较高的保守型、与激酶的特异性和条件特异性调控匹配度更高，其余3个位点功能未知。这些特性项有助于鉴定潜在的调控位点。同时，磷酸化位点的功能分数很好地区分不同蛋白家族的相关磷酸化位点，如LCK激酶、STAT3、PTPN11磷酸酶、H2AFX组蛋白中已知功能与疾病相关的磷酸化位点排列首位，一些分数较高的磷酸化位点也有文献显示具有调控功能。磷酸化修饰通过多种分子机制调控蛋白功能，磷酸化位点的功能分数在各种机制中并无偏好，但是优先预测蛋白质-蛋白质间相互作用和转录活性相关的调控功能。例如RANBP1的S60可被PLK1调控，是分数最高的磷酸化位点；该位点能够被冈田酸（okadaic acid）上调，靠近Ran相互作用界面和跨膜核转运蛋白Ran GTPase激活蛋白1。RANBP1与RAN、RCC1、NEMP1具有相互作用，但突变S60E导致RANBP1与NEMP1的结合能力显著降低。综合分析77个乳腺癌样本的磷酸化修饰和基因表达数据，研究转录因子活性和转录因子磷酸化水平间相关性。例如STAT1，其pS727意味着完整转录激活。基于基因表达所衡量的转录因子活性越高，S727的磷酸化越高。磷酸化的功能分数能够鉴定出磷酸化变化与转录因子活性相关的位点。一个具有功能的磷酸化位点预期在基因组中具有遗传限制性，高度功能化的磷酸化位点应该对变异的耐受性较低。对健康人群和疾病人群的遗传变异进行分析，变异发生在磷酸化位点且功能分数高的情况较为稀少。对功能分数高的磷酸位点引入突变或将导致严重的功能失衡。分析1092个影响受体-磷酸化的突变对功能丢失和增加的影响，发现功能分数越高，其突变产生后果的可能性越高。例如，GAPDH上S151、T153两个位点位于高度保守区域催化残基C152的侧翼，功能分数很高，但功能未知。在酿酒酵母中突变GAPDH基因（TDH3），TDH3缺失降低阿霉素处理下生长速度，破坏这两个位点的磷酸化导致酶活性显著降低，导致急性生长缺陷。研究人员进一步探索功能分数鉴定的磷酸化位点在SMARCC2功能的调控。SMARCC2是人SWI/SNF染色质重塑复合物的组成，在神经生成中有重要作用。在小鼠胚胎干细胞中突变功能分数较高的S302和S304位点，纯合突变导致分化的延迟，上调小鼠多能干细胞相关基因，下调神经元分化基因特征，SMARCC2信号下游作用蛋白REST的靶基因显著下调，神经形态学特征也表明分化程度较低。总的来说，研究提供了较为全面的人类蛋白磷酸化组参考图谱，使用机器学习开发了蛋白磷酸化的功能图谱，为研究蛋白质的磷酸化位点及功能提供了新的资源和工具。2019年CNS蛋白组学研究精选
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1. Sharma, K. et al., (2014) Ultradeep human phosphoproteome reveals a distinct regulatory nature of Tyr and Ser/Thr-based signaling. Cell Rep.2. Hornbeck, P. V. et al. PhosphoSitePlus, 2014: mutations, PTMs and recalibrations. Nucleic Acids Res. 3. Torres, M. P., et al., (2016) Proteome-wide structural analysis of PTM hotspots reveals regulatory elements predicted to impact biological function and disease. Mol. Cell. Proteomics.David Ochoa. et al., (2019) The functional landscape of the human phosphoproteome. Nature Biotechnology.https://doi.org/10.1038/s41587-019-0344-3
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