衰老，一直以来都是国自然研究热点之一，其热度居高不下。不过，衰老是个很大的领域，而干细胞具有多能性和再生性，因此常与衰老相联系。类器官技术虽还处于刚起步阶段，但因其易于建立、与起源组织具有高度相似性等特征，越来越多研究者将目光从动物身上转移至类器官这一国自然新秀身上。衰老相关分泌表型（SASP）相关的炎症被认为与衰老和患病动物的组织功能障碍有关。类器官属于三维(3D)细胞培养物，包含其代表器官的一些关键特性，可作为组织再生模型。因此，作者采用肠道类器官作为组织再生的模型，来剖析SASP因素对干细胞功能的影响。将类器官、衰老与干细胞联合起来研究，表明衰老细胞分泌的因子可以对上皮再生和干细胞功能产生直接影响，这些影响可能导致与年龄相关的组织功能障碍和致癌转化。让梅斯小编带大家一起解析、学习这篇发表在Nature子刊上的文章研究思路吧！首先是构建肠道类器官。作者从小鼠小肠中分离出隐窝（肠道类器官），培养在鼠胚胎成纤维细胞的条件培养基（CM）中，经X射线照射或多柔比星治疗诱导衰老。作者发现，暴露在衰老CM（SCM）条件下的类器官表现出显著的成球性，缺乏隐窝结构，类似于衰老细胞，而暴露在静止CM（QCM）条件下的类器官则表现出正常的隐窝出芽。Ki67和pH3染色都表明QCM和SCM处理的类器官都表现出增殖活性，暗示暴露于SCM并不会导致类器官的继发衰老。接下来，作者评估了类器官衰老表型是否存在细胞组成的变化。通过比较类器官中各种细胞标记物的转录水平，发现SCM类器官的分泌细胞标记物的表达大幅降低，而其他细胞则没有。至关重要的是，由SASP因子引起的形态变化是可逆的，作者将隐窝结构明显的类器官由QCM转移至SCM时，类器官出芽减少、囊性隐窝结构减少，而将类器官从SCM转移至QCM则发现了相反的结果。综上所述，这些数据表明SCM在肠道干细胞谱系中引起细胞分化的特异性和可逆缺陷。研究思路：首先是构建表达衰老表型的类器官，研究衰老表现的类器官与正常类器官之间存在的区别，结合衰老相关分泌表型（SASP）特征，发现它们所分泌的因子存在差异。而进一步，作者研究了改变条件能否逆转这一差异，结果与预想一致。二、分泌的Ptk7是导致囊性类器官表型的SASP因子为了鉴定SCM中导致类器官形态变化的因素，作者采用质谱（MS）分析了SCM中的各种因子，发现差异存在于培养基部分中的蛋白质之一是Ptk7的N末端细胞外结构域，而这一表达也可在肠道类器官中检测到。此外，作者还发现，与QCM处理的类器官相比，SCM处理的类器官中脱落形式的Ptk7（sPtk7）表达更高。以上结果表明，Ptk7是SASP中的常见成分。研究思路：明确了SASP在肠道类器官中的作用后，进一步便是明确SASP众多因子中主要发挥作用的因子是什么。作者采用质谱分析发现Ptk7高表达，之后验证发现其的确在SCM培养的类器官中高表达，为后续研究铺垫。作者在老年小鼠的肠道中也检测到了高表达的Ptk7，而已知Ptk7的N端结构域在被基质金属蛋白酶14（MMP14）和金属蛋白酶17（ADAM17）切割后脱落，因此作者进一步检测了ADAM和MMP水平，发现衰老细胞中的ADAM和MMP水平表达增加。作者进一步验证了ADAM和MMP水平降低会使得囊性类器官表型减少，sPtk7表达减少。那sPtk7会不会是导致囊性类器官表型减少的原因呢？作者在SCM中阻断Ptk7的表达后发现囊性类器官表型被抑制。综上，作者发现了SASP因子sPtk7，该因子通过金属蛋白酶从衰老细胞中释放并破坏肠道类器官形态。研究思路：作者发现了sPtk7在SCM培养的类器官中高表达，那在衰老小鼠中是否也存在一致的情况？二者有无等同性？且sPtk7是如何在肠道中高表达的呢？经过验证，作者发现衰老肠道类器官与衰老小鼠肠道中所发现结果一致，且证明了Ptk7经金属蛋白酶切割成sPtk7而发挥影响。众多研究已表明，Ptk7能与Wnt通路相互作用，但Ptk7在肠道干细胞中如何发挥作用仍不清楚。作者采用不同的FZD抑制剂分别处理，发现FZD7和FZD8（参与非典型Wnt信号通路）的抑制能消除类器官的囊性形态。而加入Wnt配体（Wnt3a和Wnt5a）则能使类器官出现囊性形态，但抑制FZD7或Ptk7后这一现象消失。进一步研究发现FZD7和Ptk7都能和Wnt配体结合，并且是结合于不同位点。这些结果表明Ptk7 / FZD7 / Wnt形成三元复合物以激活Wnt信号传导。研究思路：明确了Ptk7对于囊性类器官表型的调控作用，也明确了是什么调控的Ptk7，接下来便是了解Ptk7如何调控囊性类器官表型。Wnt5a介导的非经典Wnt信号能通过调整胞质Ca2 控制细胞增殖和代谢，但Ca2 是否会影响肠道干细胞的功能仍不清楚。作者发现，Wnt5a处理后的类器官中细胞的Ca2 基线跟表达增加，Wnt3a处理则导致Ca2 表达下降。而作者在用SCM处理类器官时也能出现与Wnt5a处理后相同的现象，但加入Ptk7抗体后则不能引起Ca2 表达变化。TFP是多功能Ca2 结合蛋白钙调蛋白抑制剂，用TFP及其他抑制剂处理类器官后囊性形态的比例显著减少了。以上结果表明，Ptk7调控胞质Ca2 信号从而导致类器官的囊性形态。研究思路：作者在研究Ptk7通过非经典Wnt信号来调控囊性类器官表型时发现率Ca2 也出现了变化，结合Wnt5a介导的非经典Wnt信号能通过调整胞质Ca2 控制细胞增殖和代谢，因此作者进一步分析了Ptk7与Ca2 间的联系。六、SASP暴露类器官中的YAP/TEAD靶基因富集作者通过转录组和差异基因表达分析，发现Wnt5a处理组中差异表达基因有一半与SCM引起的差异表达基因相同，而两组间不同的差异表达基因则大部分都是Ptk7依赖性的，证实了Ptk7在SCM诱导的衰老表型中的关键作用。作者通过转录因子结合基序分析发现，依赖于Ptk7和非依赖于Ptk7之间有大量的差异表达基因，Ptk7依赖性差异表达基因对TEAD结合基序表现出强烈的富集，而Ptk7独立DEG对Hdac2、Hnf4g和Hnf1a结合基序表现出富集。进一步发现大多数具有TEAD结合基序的依赖于Ptk7差异表达基因都在SCM或Wnt5a响应下表达上调，且都是已知的YAP靶基因。这些数据表明，由Ptk7或Wnt5a引起的囊性类器官表型可能是由YAP/TEAD活性升高引起的。研究思路：金属蛋白酶调控SASP因子Ptk7转变为sPtk7，而Ptk7通过非经典Wnt通路来调控囊性类器官衰老表型。研究到这，基本故事就已经可以画上句号了，但是作者还进一步分析了基因层面，研究究竟是哪些基因影响的SASP分泌。上述结果表明，Ptk7和Wnt5a可能通过激活YAP/TEAD起作用，于是作者便开展了后续验证实验，发现经SCM或Wnt5a处理后，核YAP表达增加。Ca2 信号传导与YAP的调节有关，加入TFP后能抑制YAP核易位。而加入YAP或TEAD抑制剂后，囊性类器官表型表达减少。以上结果表明，非典型Wnt-Ca2 信号传导促进肠道干细胞YAP/TEAD激活，影响暴露于SCM或Wnt5a的类器官囊性形态。研究思路：发现YAP是影响SASP的基因，那后续便是验证YAP是否影响囊性类器官表型。SASP因子Ptk7的N末端结构域在衰老肠道中升高，通过肠道干细胞上的Fzd受体激活Wnt/Ca2 信号传导，进而触发YAP的核易位并诱导肠道干细胞分化缺陷。这项研究表明，衰老细胞分泌的因子也可以对上皮再生和干细胞功能产生直接影响，而这些影响可能导致与年龄相关的组织功能障碍和致癌转化。参考文献：
[1] Yun J, Hansen S, Morris O, et al. Senescent cells perturb intestinal stem cell differentiation through Ptk7 induced noncanonical Wnt and YAP signaling. Nat Commun. 2023;14(1):156. Published 2023 Jan 11. doi:10.1038/s41467-022-35487-9
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