质谱多组学
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背景介绍
近两年生物医学界最火的关键词是什么？毫无疑问是肠道微生物！肠道微生物文章以平均每周一篇的速度刊登各大顶级期刊，且多次荣登在CNS三大正刊封面。
Nature，2016
肠道菌群为什么这么重要？这与它对人体的巨大影响有关：人体肠道菌群约有1000多种，细胞数量达到1014个（约人体细胞的10倍），是人体的一大隐形的“器官”，对营养物质代谢、人体自身发育、免疫及疾病的产生等方面都起到极其重要的作用，与肥胖，糖尿病，婴幼儿发育，肠道炎性疾病，心血管疾病，阿尔兹海默症等多种疾病的研究密切相关。针对这些系统疾病，研究人员的目光已逐步转移到肠道微生物研究上。
2007年，NIH提出了人类微生物组计划（Human Microbiome Project, HMP）。该计划分为2个阶段。第一阶段主要以健康人群为对象描绘了人体微生物的全景图。第二阶段的人类微生物组计划作为第一阶段的延续，联合多组学研究策略探究微生物在健康与疾病中扮演了什么角色。
Nature，2019
经过12年的努力，2019年5月，《Nature》杂志公布了人类微生物组计划第二阶段-人类微生物组整合计划（Integrative Human Microbiome Project，iHMP或HMP2）的完成。该计划包括了微生物组与早产、微生物组与炎症性肠病、微生物组与前驱糖尿病三部分研究内容，即三种与微生物组关联性最为紧密的生理或病理状态。
iHMP研究进展
在我国，肠道微生物研究也炙手可热：2017年，中国肠道宏基因组计划正式成立。随后不久，中科院微生物研究所牵头的中国科学院微生物组计划正式启动。国自然也将肠道菌群研究作为了资助重点。
人类与微生物的互作研究持续了几十年，近几年才是最繁荣的时代：各研究方向均有新的研究成果报道。这一切得益于基于测序和质谱技术的微生物组学（宏基因组/宏蛋白组/宏代谢组）的发展，使得科研工作者可以从各个维度对肠道菌群的组成和功能进行研究。因此，肠道菌群也从以前对不同微生物组构成与人体症状之间的关系的研究，迅速扩展至不同微生物群体、其综合功能及其对宿主病理生理的作用机制。
研究方法
肠道微生物的研究分为基因、转录、蛋白、代谢等多个层次。不同层次的研究侧重均有各自的技术方法。
肠道微生物系统研究方案
菌群多样性研究：16S rDNA扩增子测序用于分析微生物群落的构成和丰度差异，低成本快速高效，是用于分析微生物群多样性的不二之选。
菌群功能研究：宏基因组、宏转录组、宏蛋白质组学偏向于菌群功能研究。不同的是宏基因组和宏转录组反映的是可能发生和很有可能发生的事，而宏蛋白能够真实的反映肠道菌群基因和转录层面的变化在蛋白层面是否发生以及发生的进程。通过搞清楚这些蛋白的“功能”，能够更好地理解肠道菌群对宿主的调控机制。
宏基因组学 代谢组学以及16S rDNA扩增子测序 代谢组学是目前广泛使用的多组学研究技术；其中16S rDNA扩增子测序 代谢组学非常适合前期的探索性实验。通过16S与代谢的关联分析，可以弄清楚肠道菌群结构的改变对肠道菌群代谢状态以及功能性代谢小分子的影响，或者对宿主代谢表型的影响，通过一些可视化的工具，还能对一些关键的菌株进行筛选，进一步挖掘其中的作用机制，是非常高效的一种研究手段。
肠道微生物领域研究进展
3.1 代谢性疾病
肥胖：Gut microbiome and serum metabolome alterations in obesity and after weight-loss intervention. Nature Medicine, 2017.
宏基因组 非靶代谢 靶向氨基酸检测
上海交通大学附属瑞金医院洪洁教授、王卫庆教授、宁光院士等人以257名中国汉族青少年为研究对象，首次揭示中国肥胖人群的肠道菌群组成，发现一系列丰度显著异于正常人群的肠道共生菌，其中多形拟杆菌丰度在肥胖人群明显下降，进一步通过代谢组学分析血清代谢物水平，发现肥胖人群中谷氨酸的含量显著高于正常体重人群，并且其含量与多形拟杆菌数量呈反比。进一步通过小鼠灌胃实验、肥胖患者减重手术实验证实多形拟杆菌水平的恢复可能有助于肥胖患者的减重过程。
糖尿病：Longitudinal multi-omics of host–microbe dynamics in prediabetes. Natrue, 2019.
16S多样性分析、蛋白组、代谢组、转录组和基因组
斯坦福大学医学院的Michael Snyder教授联合Jackson基因组医学实验室George Weinstock教授领导团队担负iHMP项目中关于微生物组与前驱糖尿病的相关研究。此项研究在4年内每3个月对106位受试者进行健康走访，采集了受试者健康状态及生病状态下的血液、粪便和鼻拭子样本，联合16S多样性分析、蛋白组、代谢组、转录组和基因组等组学技术，揭示了在健康状态下和疾病发生时葡萄糖代谢失调个体和健康个体间生物学通路和生理反应的差异性，并为进一步研究健康状态、前驱糖尿病状态和T2D状态的区别与内在联系提供了一个开源的数据库。
3.2 心血管疾病
TMAO: Gut Microbial Metabolite TMAO Enhances Platelet Hyperreactivity and Thrombosis Risk. Cell, 2016.
16S rDNA扩增子测序 宏基因组 靶向TMA/TMAO检测
美国克利夫兰诊所研究者从4007例受试者着手，前瞻性的对其进行为期3年的血栓事件（MI、中风）随访, 结果发现TMAO以浓度依赖方式与血栓事件风险显著正相关。随后动物实验发现肠道菌群在胆碱-TMAO-血小板凝集-血栓的转化过程扮演着重要的作用，接着通过16S rDNA扩增子测序对菌群微生物多样性进行分析，比较与对照组之间的差异，以明确特定种群在其中的作用，然后进一步的通过宏基因组对菌群、蛋白和功能进行分析。最后通过粪便移植技术进一步证实。因此这篇文章揭示了饮食-肠道微生物-血栓风险三者之间的关系。
3.3 肠道疾病
结直肠癌：Gavage of Fecal Samples From Patients With Colorectal Cancer Promotes Intestinal Carcinogenesis in Germ-Free and Conventional Mice. Gastroenterology, 2017
16S rDNA扩增子测序
将结直肠癌患者的粪便移植给了有癌症发生条件的小鼠会促进了小鼠肿瘤的出现。16S rDNA扩增子测序发现移植了结直肠癌患者粪便小鼠肠道中的微生物丰度相比移植健康人的来说明显下降，产细菌毒素脆弱拟杆菌的数量逐渐增加，抗炎类普氏粪杆菌等细菌逐渐减少。进一步实验的实验结果表明结直肠癌患者粪便中存在的微生物群可以影响多个促炎因子和肿瘤形成相关基因的表达。这项研究提供了结直肠癌患者肠道微生物可促进癌症发展的直接证据。
3.4 神经系统
癫痫：The Gut Microbiota Mediates the Anti-Seizure Effects of the Ketogenic Diet. Cell, 2018.
16S rDNA扩增子测序 非靶代谢
生酮饮食能够大幅改变肠道菌群的结构，增加A. muciniphila 和Parabacteroides spp. 这两种细菌的丰度，有效减少减少癫痫的发作，并且只有当这两种细菌同时存在时才能阻止癫痫发作。进一步检测肠道内容物、血液、海马体的代谢物，研究人员发现生酮饮食引起升高的肠道细菌主要是通过引起血液中谷氨酰化氨基酸的减少，海马体GABA/谷氨酸的升高来促进体内癫痫发作的保护。
3.5 肝脏疾病
肝癌：Gut microbiome-mediated bile acid metabolism regulates liver cancer via NKT cells. Science, 2018.
16S rDNA扩增子测序 靶向胆汁酸检测
美国国立卫生院研究人员把小鼠分为正常组和抗生素处理组，分别通过四种不同的肿瘤模型来探究肠道菌群对肝癌发生发展的影响。研究发现，与WT组相比，喂食抗生素的小鼠对肿瘤的形成有明显的抵制作用。进一步研究发现C. scindens 这种肠道细菌参与胆汁酸的代谢，在抗生素的处理下，这些细菌数量开始下降，让胆汁酸开始积累，从而促进CXCL16的表达，提高NKT免疫细胞的数目，对肿瘤产生抑制效果。这项研究的重要意义在于确定了肠道微生物影响肝脏免疫应答的完整机制。
3.6 药物
免疫治疗：Gut microbiome influences efficacy of PD-1–based immunotherapy against epithelial tumors. Science, 2018.
宏基因组
249名接受抗PD-1免疫治疗的肺癌、肾癌、膀胱尿路上皮癌等多名癌症患者，发现在免疫治疗前接受抗生素治疗的患者，治疗效果差。通过对抗PD-1免疫疗法作出反应的癌症患者和未作出反应的癌症患者的肠道微生物组进行了比较，发现A. muciniphila 菌能够增强免疫治疗的效果。 通过粪便移植技术将对免疫疗法作出反应的癌症患者和未作出反应的癌症患者的粪便微生物组移植到无菌的或者接受抗生素治疗的小鼠体内，发现那些接受来自对这种免疫疗法作出反应的癌症患者的粪便微生物组移植的小鼠对这种免疫疗法作出的反应得到更好的改善。
小结
肠道微生物是当前热点研究方向，研究证实肠道微生物与代谢性疾病、心血管疾病、肠道疾病、神经系统疾病、肝脏疾病等发生发展密切有关，因此精准医疗下离不开对其研究。此外，药物会影响肠道微生物。肠道微生物的变化会导致药物副作用，但也有可能是药物发挥效应的过程。未来针对肠道微生物做药物安全性、有效性评价或许会是标准动作。肠道微生物也为传统中医药的现代化提供了一个良好的契机和方向。
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