基于Split-GFP的蛋白-蛋白相互作用检测是研究包括植物在内的活体细胞蛋白复合物互作和定位的常用方法。然而，GFP等荧光蛋白不适合于高精度的3D成像和超分辨率成像，原因在于：(1)长时程观测容易造成严重的光漂白现象，丢失信号；(2)荧光强度依赖于蛋白表达丰度；(3)荧光闪烁现象(荧光强度的随机涨落)；(4)容易形成蛋白寡聚体。而HaloTag系统可以有效克服以上短板。2020年6月8日，生物预印本biorxiv杂志在线发表了来自德国布伦瑞克工业大学的Robert Hänsch实验室题为“Split-HaloTag Imaging Assay for invivo 3D-Microscopy and Subdiffractional Analyses of Protein-ProteinInteractions”的研究论文。该研究首次将Split-HaloTag系统应用于植物的活体成像，更为重要的是，Split-HaloTag系统适用于高质量的3D成像和高精度的超分辨成像。HaloTag蛋白是由红球菌(Rhodococcus rhodochrous)的卤代烃脱卤素酶DhaA改造而来，该蛋白标签可以和人工合成的卤代烃配体形成稳定的共价键。HaloTag系统配备了许多宽光谱、高稳定性的荧光配体，包括红色荧光的TMR ，绿色荧光的Oregon Green和黄色荧光的DiAcFAM。这些荧光配体可以通过剂量调整，实现全标记、半标记甚至单分子标记，摆脱了蛋白表达丰度的限制。此外，HaloTag蛋白具有稳定的单体构象，不会造成融合蛋白的聚集。Robert Hänsch实验室2006年最早在植物中实现了基于HaloTag系统的蛋白标记成像，表明该系统适用于植物。随后，又有研究报道了HaloTag蛋白像GFP一样可以进行分离和重组，因而激发了Robert Hänsch开发基于Split-HaloTag的蛋白互作成像技术。在本研究中，作者将HaloTag蛋白的N端和C端分别融合到拟南芥钼蝶呤合酶异源四聚体的两个亚基Cnx6和Cnx7上，共转化烟草并施加荧光配体TMR后进行激光共聚焦成像。结果显示，野生型对照以及单独的转基因材料未收集到明显荧光信号，而实验组共转化的材料表现出细胞质特异的信号，由此证明Split-HaloTag蛋白在植物体内可以有效重组（如下图）。同时作者通过平行实验测试了Split-HaloTag和Split-GFP在一般光学成像研究中的效果，发现两者的结果基本一致。基于以上结果，作者进一步测试了Split-HaloTag和Split-GFP系统在深度成像方面的性能。首先，在微米级的3D成像实验中，长达数分钟的扫描时间对Split-GFP系统造成了严重的光漂白，而Split-HaloTag系统表现出优越的稳定性。其次，利用偏振调制超分辨率显微镜(SPoD)成像，Split-HaloTag系统可以清晰重建单个微管纤维的分支和蛋白结合的超分辨图像，表明Split-HaloTag系统同样适用于超分辨成像（如下图）。总之，该研究首次将Split-HaloTag系统应用于植物的活体成像，该系统在一般光学成像效果上可以和Split-GFP相当或更佳；重要的是，Split-HaloTag系统也适用于高质量的3D成像和高精度的超分辨成像，填补了Split-GFP的空白，具有重大的应用前景。
论文链接：
https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.06.08.139378v1
我们公众号曾报道了科学家植物细胞图谱(Plant Cell Atlas)计划，其目标是绘制高分辨的植物细胞分子时空图谱（【Trends Plant Sci】科学家提出植物细胞图谱（Plant Cell Atlas）计划！）。在该文中作者重点讨论了绘制植物细胞图谱所需的关键技术，我们相继报道了近来在植物单细胞转录组测序技术、基于临近标记的植物蛋白组学技术、基于纳米颗粒的基因转化技术的突破，加上本研究在高精度蛋白互作成像技术领域的突破，植物细胞图谱所讨论的关键技术已经基本成为现实，期待植物细胞图谱计划概念能早日落实。微信加群
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