肿瘤的EMT和MET
肿瘤的EMT和MET作为肿瘤发生发展过程中的两个重要程序，已经有很多论文对此进行阐述和研究。深入学习、了解EMT、MET有助于提高我们对肿瘤的认识，帮助我们在研究过程中找到idea，获得一些思路的启发。2020年10月1日，哥伦比亚大学赫伯特·欧文综合癌症中心Anil K. Rustgi教授在Cell子刊《Trends in Cell Biology》上发表了重磅综述，系统性地阐述了EMT、MET、可塑性和肿瘤转移以及它们之间关系。
为了帮助大家更好的吸收综述的内容，榨干其每一滴精华，本工在阅读综述的时候，也给大家翻译了遍，希望能给大家带来有真正价值的“学术营养”。大家也可通过回顾、结合之前的综述来认识肿瘤，包括《肿瘤转移的百般花样儿，都逃不过这篇顶刊重磅综述的火眼金睛！》和《37分Nature子刊的重磅综述刷新你对肿瘤的认识》。
2. 细胞可能会沿着EMT-MET连续谱移动，因此EMT和MET可能不是一分为二的命运，部分EMT（pEMT）就证明了这一点。
3. EMT和MET在原发肿瘤发生和转移中的要求是与背景相关的，需要对所采用的模型系统进行严格的评估。
摘要
在原发肿瘤的发生、发展和转移过程中，癌细胞在上皮-间充质转化（EMT）和间充质-上皮转化（MET）等过渡期都需要细胞的特性（identity）和可塑性。EMT、MET和部分状态（称为pEMT）的功能作用可能因肿瘤类型、扩散状态和转移定植程度的不同而不同。在本文中，我们回顾了EMT、MET、pEMT和可塑性与肿瘤转移的关系。
肿瘤中的可塑性
细胞特性（identity）反映了细胞在生命周期中的发育途径以及细胞非自主和自主因素。细胞可塑性意味着细胞适应不断变化的环境的能力，这种适应要么是可逆的，要么是不可逆的。细胞可塑性在干细胞生物学、再生医学和癌症生物学中的应用越来越多，尽管可塑性这个术语本身也还在进化中。
许多基因组、遗传、表观基因组、转录和蛋白质组因子共同作用于正常细胞，使其向恶性细胞的转化。这些因素与肿瘤微环境中不同类型的细胞有着复杂的相互作用。一旦癌细胞通过肿瘤间质发生侵袭，肿瘤细胞就有能力扩散到循环中，并在远处的器官中定植，后者受到转移前生态位和器官趋向性的影响。越来越清楚的是，发生EMT时，细胞失去上皮细胞特性，获得间充质细胞的特征，这不仅在发育和伤口愈合中起关键作用，而且是原发肿瘤形成和转移的显著特征。MET是EMT的逆转过程，在发育、诱导多能干细胞重编程和肿瘤转移过程中表现明显。在本文中，我们回顾了EMT在体内的证据，总结了EMT对肿瘤进展是否是必要的现有证据，讨论了MET在转移性生长中的证据和潜在的临床相关性，评估了潜在的治疗意义，并在最近综述文章的基础上总结了该领域的突出问题。
肿瘤细胞可塑性
通过对乳腺癌、胰腺癌和卵巢癌的EMT的研究发现，上皮样细胞向间充质样细胞的转化不太类似于光的开关（只有开/关两档），而更像是一种调光开关（可调节大小的连续调节开关）。在许多恶性病例中，表型和功能的改变似乎跨越了一个连续体。这些不同的情况产生了完全EMT（complete EMT，cEMT）和部分EMT、混合（mixed）EMT或混合型（hybrid）EMT的定义。
细胞可塑性领域已经产生了几个术语来描述存在于完全上皮或间充质表型之间的细胞：pEMT、杂交型EMT和混合型EMT。虽然这些术语通常可以互换使用，但重要的是要认识到这些术语和细微差别的起源。
术语“混合（mixed）EMT”，或混合瘤，可能起源于Chase等人，他们描述了具有上皮样形态的角蛋白 /波形蛋白 肉瘤细胞。间质细胞被认为对恶性上皮细胞的生长有反应，但我们现在知道这可能是细胞可塑性的结果。
已经证明了自发性“杂交（hybrid）EMT”态的存在。Pastushenko等人发现原发性皮肤和乳腺肿瘤需要发生EMT。在肿瘤内，发现了不同程度上皮和间质特征的细胞亚群，包括具有中间或混合特征的细胞。上皮和间质连续谱上的细胞在细胞可塑性、侵袭性和转移潜力方面存在差异。重要的是，具有杂交表型的细胞亚群在形成转移方面更明显。Kröger等人强调了细胞可塑性在转移中的重要性，他们证明了杂交EMT细胞不能通过混合稳定的上皮状态细胞和稳定的间质状态细胞来实现表型复制（phenocopied）。处于杂交状态细胞的动态特性对于提高转移潜力很重要。
最后，pEMT被用来描述稳定或动态性处于上皮-间充质中间状态的细胞。这种“部分”表型可以表现为同时表达上皮和间充质的标志物，或失去上皮标志物也不获得间质标志物。近年来，pEMT作为观察完全性EMT（Complete EMT，cEMT）的另一种方法获得了广泛的关注，cEMT的特征是上皮标志物发生抑制或失活，同时获得间质标志物。
为保持一致，我们将向间质状态的不完全转变称为pEMT。Panchy等人最近使用转录分析证明细胞可以在上皮和间充质谱上达到很高的程度。几篇评论文章也都强调了这一现象。
肿瘤模型中的cEMT和pEMT
对“EMT发生在肿瘤发生过程中”这一假说的一个中心挑战是，许多最初的证据是基于EMT转录因子（EMT-TF）的调控，从而产生了关于EMT是否是一个生理相关过程的争议。荧光谱系标记的自发性转移基因工程小鼠模型（GEMMs）的建立，为研究内源性EMT-TF表达驱动的体内EMT提供了有力的工具。在这里，我们定义了完全性cEMT和pEMT的特征，并回顾了生理条件下多种肿瘤类型的从头EMT的证据（图1和图2）。
Beerling等人将肿瘤细胞特异性YFP谱系标记引入依赖于多瘤病毒中T抗原（PyVT）表达并受小鼠乳腺肿瘤病毒启动子控制的小鼠乳腺癌模型[称为MMTV-PyMT小鼠（表1）]。这个模型让我们得以一窥经典的EMT-TF在细胞经历EMT时所扮演的角色。为此，通过上调E-cadherin（Ecad）阴性群体中经典的EMT-TF（如Snail、Slug、Twist、ZEB1/2），鉴定了Ecad阴性和Ecad阳性肿瘤细胞亚群（图1）。重要的是，原位移植和活体显微镜结果显示，这些正在发生EMT的Ecad阴性肿瘤细胞正是迁移的细胞，并可能启动了转移级联反应。虽然这并不能证明其必要性，但它证明了EMT的存在。在一个相关的模型中，在Fsp1-cre启动子控制下带有RFP-to-GFP开关的小鼠MMTV-PyMT细胞被移植到NOD-scid Il2ry(null) B2m(null)（NSG-β2m−/-）小鼠体内（表1）。
在这些条件下，根据Fsp1表达的结果，任何发生了EMT的细胞都会将荧光从红色变为绿色。在发生EMT的GFP 细胞群中观察到同时有Ecad缺失，表明在这种GEMM中确实发生了间充质转化。对RFP /Ecad-细胞亚群的观察表明，有更多的细胞发生了EMT，但通过另一种不依赖Fsp1的途径。然而，另一组使用MMTV-Her2模型的研究表明，早期播散的细胞下调了Ecad的表达，尽管这些细胞被定义为Ecad“低”，仍认为存在潜在的pEMT。这些结果与之前在HER2驱动的GEMM中的一项研究基本一致，该研究揭示了伴随EMT的Snail自发上调。因此，带有Snail驱动的YFP的PyMT模型可导致YFP 细胞缺乏Cdh1和Zeb1表达也就不足为奇了。
在胰腺导管腺癌（PDAC）中，自发转移的GEMMs结合肿瘤细胞的荧光谱系标记已经为EMT在体内的存在提供了确凿的证据。第一个模型使用泛上皮谱系Pdx1-Cre驱动程序来表达突变的Kras G12D，同时伴随p53缺失和YFP标签（这里是KPCY；表1）。本研究证实在癌前阶段EMT细胞中存在YFP 、ZEB1 、Ecad-细胞群。使用相同的KPCY模型，Aiello等人的研究结果表明，pEMT细胞群存在上皮和间质标记的共同表达，通过集体迁移播散，而cEMT细胞群优先以单个细胞播散。这些研究表明，EMT发生在原发肿瘤进展的早期，并且随着转移级联的变化而存在不同的EMT状态。
虽然乳腺和胰腺癌GEMM一直是体内证明EMT最明确的模型，但其他模型也提供了确凿的证据。Ruscetti等人使用带有Vimentin GFP（标记间质状态）谱系标签的Pten-和Kras G12D驱动的模型（表1），以证明前列腺癌中发生了EMT（图1）。这一组也共染色（co-stained）了另一种上皮细胞标志物，上皮细胞粘附分子（EpCAM），发现pEMT细胞群为EpCAM /GFP ，而cEMT细胞群为EpCAM-GFP 。在结肠癌中，从Notch激活和p53缺失中出现的模型发现，具有VIMENTIN /GFP 间质形态但缺乏Ecad的浸润细胞群，这表明观察到了EMT（图1）。
因此，这些模型已经证明，EMT发生在没有强制EMT-TF表达的情况下从头开始，并且可能是侵袭性和转移性表型的驱动因素。然而，可以想象，这些表型可能是偶然的，EMT-TF可能有它们自己的致癌EMT非依赖性效应。接下来，我们转向EMT在肿瘤的发生和发展过程中是必要的还是可有可无的的问题。
EMT：必要的还是可有可无的？
为了评估EMT在肿瘤转移中的潜在可免性（dispensability），在乳腺癌、胰腺癌、皮肤癌和肺癌的研究中使用了类似的范式：删除移植或遗传小鼠模型中已知的EMT-TF，并评估转移负荷是否受到影响。
在胰腺癌模型（Pdx1-cre；Kras G12D；p53 R172H）中，当Snail或Twist1被独立敲除时，其原发肿瘤组织学、肿瘤进展和转移不受影响。每种模型都显示出Zeb1、、Zeb2、Sox4 和Slug的降低，这表明至少这些EMT-TF不能补偿Snail或Twist的缺失，尽管不能排除其他EMT-TF的补偿。有趣的是，EMT-TF基因的敲除与化疗敏感性相关，这归因于核苷转运蛋白表达的增加。这些数据为临床现象提供了可能的解释，即肿瘤中具有更多间质特征的患者预后更差。
虽然Snail和Twist各自都是可有可无的，但同一遗传背景下的Zeb1基因敲除会妨碍（impairs）肿瘤发生的多个阶段，从癌前病变到转移瘤。在两种人类胰腺癌细胞系中，ZEB1的短发夹状（shRNA）敲除减少了原位移植小鼠模型的进展，证实了Zeb1在胰腺癌中的重要性。这表明潜在的EMT可分配性取决于哪个EMT-TF正在驱动这一过程，并暗示了EMT-TF之间可能的层次（hierarchy）关系。
相比之下，在Snail和Twist基因敲除小鼠模型中，在其他的EMT-TF中，Zeb1也降低了。这证明了是否存在对EMT-TF所介导的作用对时间的依赖性要求；例如，可诱导的Zeb1基因敲除是否会对转移潜力有不同影响，取决于Zeb1是在癌前阶段还是在肿瘤阶段被敲除。
潜在的EMT可免性问题也延伸到了其他癌症。在乳腺癌中使用三重转基因乳腺癌小鼠模型MMTV-PyMT对此进行了研究。利用这一系统，作者证明了12周龄的自发性肺转移灶仍然是Ecad /RFP 。任何发生EMT的细胞都会开启Cre重组酶并不可逆转地缺失RFP表达（表1）。这表明这些转移性癌细胞从未表达过Fsp1，并提出了一个潜在的Fsp1非依赖性EMT程序的前提。
在另一项研究中，高miRNA 200（Zeb1和Zeb2的抑制因子）在小鼠模型和人类组织中表现出了对乳腺癌转移的阳性预测价值。无转移生存率与miR-200家族成员的高表达显著相关，从而表明低Zeb1/Zeb2与低（reduced）转移相关。有趣的是，Ecad并不能预测患者的存活率，这表明Ecad的表达在复发和无复发的患者之间没有区别。这一结果揭示了以下考虑因素：
（I）Zeb1/Zeb2驱动的EMT是可有可无的；
（II）可通过不依赖于Ecad的机制抑制EMT从而促进转移。
作者能够进一步证明，在乳脂垫（mammary-fat-pad）注射模型中，miR-200的异位过表达增强了转移。此外，他们还证明了异位Ecad的表达增强了转移，但不如miR-200有效。这表明Ecad的修复只是MET程序的一部分，抑制EMT-TF还可通过其他机制促进转移，包括调节分泌因子。
Zeb1 在这里的可有可无与胰腺癌对Zeb1的要求相反，尽管有两点不同：胰腺癌模型是直接的基因敲除，而乳腺癌数据依赖于移植模型中miR-200对Zeb1的抑制。然而，它确实提醒人们，不同的EMT-TF有不同的作用，不同的癌症可能有不同的EMT-TF功能层次。
这个乳腺癌模型让人联想到胰腺中的Snail/Twist1基因敲除模型，它证明了化疗耐药与EMT有关。在后一种情况下，环磷酰胺（一种常用的乳腺癌化疗药物）的治疗结果显示，只有RFP 细胞（即那些没有发生EMT的细胞）显示出更明显的凋亡，而GFP EMT细胞没有受到影响。值得注意的是，化疗也改变了转移病灶的EMT特征。对照组小鼠完全表现出RFP /非EMT肺转移，而化疗组小鼠表现出显著的GFP /EMT肺转移，这表明EMT在特定条件下是“开启”的。
EMT-TFs的可免性在维持EMT在胰腺癌和乳腺癌转移中的作用受到了强烈的挑战。理由是，删除Snail或Twist并不能完全消除EMT程序/过程，pEMT程序可能会在转移性胰腺癌中持续存在。此外，他们得出结论，EMT是通过多个EMT-TF之间复杂的相互作用来实现的，删除一个因素的系统不太可能用来反应整体的复杂性。特别是，Zeb1、Sox4和Slug在Snail或Twist被删除后仍然存在，这可能表明EMT残余的持久性。
以类似的方式，对乳腺癌的研究表明，驱动RFP到GFP转换的Fsp1-Cre和Vim-CreER转基因（用来标记发生EMT的细胞）并没有完全捕获整个EMT细胞群体。表明EMT需要Fsp1的实验证据是在肾细胞中进行的，这可能会激活与乳腺细胞不同的EMT程序。
此外，作者还介绍了一些研究，表明Fsp1并不是所有EMT过程中不可或缺的一部分，而且全身Fsp1基因敲除的小鼠在发育过程中仍然能够发生EMT。根据Snail或Zeb1表达的结果，发生EMT的癌细胞中只有一小部分共表达Fsp1。这些结果令人怀疑Fsp1-Cre转基因被用来标记乳腺癌发生EMT的细胞的有效性。
通过强制表达miR-200（可直接抑制Zeb1）来抑制EMT可能也会激活不依赖于EMT但对转移很重要的表型。Fischer和他的同事通过提供更多的数据来研究EMT在乳腺癌中的潜在可免性，他们发生Zeb1只在GFP 间质细胞中表达，而不是在RFP 上皮细胞中表达。他们指出，在Vim-Creer模型中，GFP EMT细胞约占原发肿瘤的5%，但在转移瘤中未发现。最后，miR-200的过表达概括了Ecad和occludin水平升高以及vimentin和Fsp1水平降低对EMT的抑制作用。
总之，EMT的必要性或可免性似乎取决于背景，更多的证据强调了EMT的必要性。此外，研究结果差异可能是pEMT的结果，也可能是所用技术的敏感性不同，或者是发生pEMT的细胞富集程度较低所致。要证明转移是以EMT非依赖的方式发生的，可能需要能够跟踪Ecad的表达和肿瘤细胞在整个血管内、循环和外渗过程中的细胞定位。Ecad表达的评估是“阳性或阴性”，这一结果不能解释pEMT，在pEMT中需要Ecad表达的细微缺失，并足以促使转移的发生。因此，在体内跟踪肿瘤细胞的整个转移级联，以及在离散的时间点分离单个细胞更有效的方法，将提高我们对各种恶性肿瘤中EMT的理解。
MET和肿瘤转移
转移部位的Ecad表达是MET的可能证据。这依赖于这样的一个假设，即EMT在转移级联中发生得更早，并且在转移部位有Ecad的重新表达。或者，也有可能肿瘤细胞从未缺失Ecad表达，或者Ecad表达只受到了最小程度的干扰（例如，在pEMT中）。这一部分的重点是证明Ecad的促转移作用以及MET在三种关键癌症中存在的证据：乳腺癌、卵巢癌和胰腺癌。
1
乳腺癌
乳腺癌的某些亚型是“Ecad作为肿瘤抑制因子”模型的一个例外。特别是，浸润性导管癌已被证明在转移部位表达Ecad。一项研究表明，在23对浸润性导管癌患者的原发肿瘤和转移样本中，所有转移灶均表达Ecad，其中10例转移部位的Ecad表达高于原发灶。这一观察结果在其他研究中也得到了重现。
炎性乳腺癌（IBC），既可以是导管癌，也可以是小叶癌，也被证明在原发和转移部位几乎一致表达Ecad。在一组IBC组织中，所有20例患者（18例浸润性导管癌和2例浸润性小叶癌）在原发部位和在淋巴管中发现所有癌栓都可表达Ecad。这些发现也得到了另一个IBC组织队列的支持。
简而言之，IBC值得注意的是它容易形成进入皮肤淋巴系统的微栓子。在转移的背景下，微栓子被认为是来自原发肿瘤的循环肿瘤细胞（CTC）阻塞毛细血管形成转移瘤的直接结果。这表明在血管内，肿瘤细胞进入淋巴血管系统的速度加快。使用一种专为建立IBC模型而创建的新移植模型，注射Ecad抗体可导致在移植小鼠中观察到的转移瘤发生溶解。此外，通过转染显性负性（dominant-negative）Ecad可以消除IBC细胞的转移特性。因此，这些肿瘤微栓子依赖于功能性Ecad。
Ecad的调控可能是由控制Ecad启动子甲基化的环境因素所驱动的。人类原发性乳腺癌在其发展的早期表现出了异质性的Ecad启动子甲基化。甲基化在侵袭过程中增加，但在球体培养的形成中减少，这表明环境因素决定了调节上皮-间充质表型的表观遗传模式，这一机制也支持/解释了人类组织研究中原发肿瘤Ecad表达减少和转移肿瘤Ecad表达增加的这一现象。
在自发性肺转移模型中观察到MET受环境因素影响的功能证据，阐述了转移前生态位在调节EMT-MET可塑性中的作用。
总之，转移前肺中的髓样细胞积聚了细胞外基质（ECM）成分，它通过降低SMAD2水平和促进细胞增殖来诱导MET。除了髓系细胞外，成纤维细胞还参与在转移部位培养了可促进MET的环境。使用与Gao等人相同的自发性肺转移模型，Pozo Martin等人的研究表明，可表达AXL（与EMT表型相关的受体）的播散性转移细胞通过THBS2激活肺成纤维细胞。这些激活的成纤维细胞反过来会抑制播散性癌细胞发生EMT。MET样癌细胞通过SMAD2/3介导来降低TGF-β信号。与Gao等人的研究结果一致，这些MET样癌细胞表现出更高的增殖水平，这可能是MET促进转移生长的原因（图2）。
值得注意的是，在尾静脉注射模型中，强制表达AXL可以显著抑制转移生长。有证据表明，环境因素可以诱导MET，这在乳腺癌骨转移中也有报道。Esposito等人论证了E-选择素（E-selectin）在骨转移中的必要性，并阐明了MET的一种非经典（noncanonical）形式。在这些实验条件下，虽然EMT-TF的表达在很大程度上没有受到干扰，但Ecad的表达仍然保持不变。
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卵巢癌
卵巢表面上皮（大多数卵巢癌的起源）通常是Ecad-，但在卵巢癌进展过程中Ecad显著上调。卵巢癌原发肿瘤部位的这种获得性Ecad在大网膜转移过程中不会发生逆转，并且胸腔和腹膜积液中的卵巢癌细胞也显示高水平的Ecad。在功能上，Ecad转导到正常卵巢上皮细胞系与肿瘤抗原CA-125的产生有关，与IBC的情况很相似，Ecad抗体的使用会导致椭圆形卵巢癌细胞簇发生解离，从而可能影响它们在积液中存活的能力。早期MET的现象并非卵巢癌所特有，在小细胞肺癌中也已经证实，MET被认为发生在转移定植之前的外周循环中。
3
胰腺癌
胰腺癌转移也与MET有关。使用谱系标记的方法追踪自发转移模型中的扩散，观察到CTC可表达EpCAM。此外，与MET和乳腺癌转移大小相关的数据一致，同一PDAC模型显示转移性肝病变的上皮属性与其大小成比例增加。具体地说，Ecad和Claudin-7等上皮标志物随着播散细胞从孤立的肿瘤细胞进化到微转移和大转移簇而增加。相反，间充质标志物，如FSP1和ZEB1，则降低。人体组织染色证实了FSP1的模式，与原发灶和大转移灶相比，微转移灶的FSP1表达最高。这表明肝转移瘤越大，它就越能体现原发肿瘤的上皮属性。
EMT-TF Prrx1的功能研究证实了PDAC中MET的概念。具体地说，传播是通过在促MET的异构体Prrx1a和促EMT的异构体Prrx1b之间的异构体切换来调节的。在原位移植模型中，Prrx1a的激活（即MET的激活）或Prrx1b的抑制（即抑制EMT）促进了肝脏的转移性生长。
研究人员已观察到CTC表现出Ecad low和Ecad high的混合状态，但转移瘤绝大多数是Ecad high的状态。有趣的是，大于3个细胞的转移性病变完全是Ecad阳性。Aiello等人在胰腺癌出现的肝转移中发现了类似的模式（图2）。一种可能是EMT-MET在循环过程中处于平衡状态，但MET在转移部位占主导地位。
EMT的一个重要反模式（counter-model）是“集群迁移（clustered migration）”或“集体入侵（collective invasion）”。集体侵袭的概念支持这样一个前提，即肿瘤细胞保留了它们的上皮特征，但又共同选择（co-opt）了癌症相关成纤维细胞（CAF）进行集体侵袭。因此，侵袭性肿瘤细胞不需要发生EMT。这些细胞簇可能以更高的转移倾向进入循环。小簇高分化细胞的萌芽可能预示着更糟糕的结果。然而，侵入性前沿的前边缘（leading edge）也可能有确实发生了EMT的细胞，而簇的大部分细胞并不发生EMT。
综上所述，大量针对乳腺癌、卵巢癌和胰腺癌的研究表明MET的重要性。在理解发生了EMT和MET（或中间状态）的细胞的动力学方面，还有很多工作要做。细胞追踪和单细胞测序等技术进步将有助于为研究这些转化所需的可塑性机制铺平道路。
MET的必要性
虽然有大量的数据展示了细胞重建上皮的特征，例如如上所述的膜性Ecad表达，但很少有证据表明这一过程是转移所必需的。细胞在沿着“间充质-上皮”这一连续谱方向移动的程度也必须被考虑。这些上皮特征是转移的定植和生长的驱动力（driver），还是由干性所引起的变化的乘客效应？转移的目标位置或原发肿瘤的位置重要吗？
为了确定哪些潜在的转录因子可能是转移定植的驱动因素，Dykxhoorn等人进行了相关研究，使用了四个等基因的小鼠乳腺癌株，每一个都表现出不同的转移能力。在植入乳脂垫后，研究小组将能够形成大转移的一种细胞系与其他三种细胞系进行了比较。他们发现，miR-200在这种特殊细胞系中的表达显著增加，与预期一致的是，Zeb2的表达会降低，而Ecad的表达则会增强。他们进一步强调了miR-200在定植中的重要性，因为它在能够侵袭转移组织但无法定殖的细胞系中过表达。在miR-200过表达的情况下，该细胞系获得了上皮特性（包括Zeb2表达降低，Snai1表达降低，Cdh1表达增加）。重要的是，miR-200过表达的细胞现在更容易形成转移，特别是在肺部。作者得出结论，一些肿瘤能够通过MET在远处发生定植。
Tsai等人在鳞状细胞癌（SCC）中为MET的要求提供了证据，他们称之为“可逆EMT”。他们采用了一种小鼠模型，在该模型中，Twist1的表达是以可逆的方式进行调节的。在口服或外用多西环素治疗时，形成乳头状瘤，凹入皮肤，形成SCC。Twist1的诱导促进了86%用局部治疗的小鼠和23%用口服治疗的小鼠发生远处转移。Twist1诱导激活EMT，促进肿瘤细胞内渗（intravasation）。此外，EMT还促进肿瘤细胞外渗（extravasation）。然而，Twist1的缺失是肿瘤细胞增殖（Ki-67 ）和形成大转移所必需的。因为没有描述其他EMT-TF的表达，所以EMT通路在转移部位可能是不依赖于Twist的，但更有可能需要EMT的逆转，即MET（图2）。这些发现表明，抑制起始性EMT信号是形成大转移瘤所必需的。
Padmanaban等人采用腔内MMTV-PyMT浸润性导管癌模型，并通过Cre诱导缺失Cdh1。用Cre感染（infected）这些小鼠模型的原代肿瘤类器官，然后将其包埋在I型胶原蛋白中。与对照组相比，Cdh1基因敲除的类器官表现出更多的侵袭和播散，但迁移的持久性和移位（displacement）降低。与对照肿瘤相比，没有Cdh1的体内移植类器官更小，大转移的数量显著减少（15倍）。此外，与对照Ecad 肿瘤相比，Ecad-肿瘤小鼠的CTC减少了7.5倍。这些结果也在多种乳腺癌模型中进行了总结。有趣的是，强制Ecad缺失并没有显著影响经典EMT转录本的表达，这表明Ecad的缺失会影响多个转移步骤，而不会强行进行完全的上皮或间质转化。此外，Ecad的缺失迫使细胞进入TGF-β依赖的活性氧（ROS）所介导的凋亡。这些结果表明Ecad对于转移细胞的有效迁移和存活是必要的，强调了Ecad和MET的促转移作用。
我们研究小组最近的工作揭示了转移性PDAC的相关情况。在KPCY PDAC模型中，p120-catenin（CTN）的丢失足以将细胞的身份从上皮细胞转变为间充质细胞，并预期会发生缺失Ecad。在p120-CTN/Ecad缺失时，转移的数量显著增加，同时从以肝转移为主转变为以肺转移为主（图2）。在没有p120-CTN或Ecad的细胞中重新表达p120-CTN也可恢复对肝的趋向性。有趣的是，与原发肿瘤相比，人类PDAC患者的肝转移瘤更具上皮性。这可能表明，在PDAC的组织背景下，MET和Ecad的表达对于特定部位的转移是必不可少的，比如肝脏，而不是肺。
Somarelli等人使用三种不同的前列腺癌小鼠模型，其中两种以MET非依赖的方式转移，另一种以MET依赖的方式转移。为了研究体内MET，该小组开发了一种基于荧光的系统，通过该系统，上皮可特异性地跳过成纤维细胞生长因子受体2（FGFR2）的外显子IIIc会导致框架内Cre基因和蛋白的表达。使用CMV-Lox-DsRed-Stop-Lox-EGFP，Ds-Red的表达仅限于间充质细胞，而EGFP的表达是上皮细胞的标志。在前列腺癌细胞株AT3和DU145中，MET被证明是一种罕见事件。
接下来，研究小组用一个表达白喉毒素A链的“自杀性报告”替换了分裂的Cre基因，这样在发生MET的细胞就会发生细胞死亡（表1）。AT3细胞在导入载体后生长，而第三种前列腺癌细胞株DT则无法生长。尾静脉注射AT3细胞后，证实有MET自杀基因的表达，形成肺转移。尾静脉注射DU145细胞也得到了类似的结果，再次表明MET不是肺转移所必需的，至少在这两个前列腺癌株中是这样的。Ecad在乳腺癌细胞系的肺转移中则是必不可少的，而缺失Ecad的胰腺癌细胞系表现出对肺的器官趋向性。
结束语
在这篇综述中，我们将重点放在EMT和MET的体内证据以及一些反对或缺乏的证据上。不同的发现并不代表对这些论点的控诉，但强调了三个关键点。首先，EMT和/或MET的存在在很大程度上取决于背景，细胞类型和组织类型是最重要的因素。其次，很多研究和其中的结论需要有活体证据，特别是使用细胞从起源到最终目的地的谱系追踪。最后，当前围绕（但不限于）单细胞基因组学、多重免疫荧光和实时成像的技术将在评估时空细胞可塑性和动力学方面非常有用。最后，我们下一步如何将过去、现在和不断发展的知识转化为靶向治疗将是癌细胞可塑性领域令人兴奋的目标。
鉴于EMT和MET被认为是必要的和促转移的，是否以及何时在疾病进展中用药物靶向这些通路，这一点还不清楚。此外，重要的是要考虑FDA批准的疗法（不是直接针对EMT-MET）对细胞可塑性的影响。
最近，Soundararajan等人探讨EMT对免疫治疗效果的阻碍（preventing）作用。已有研究表明，肿瘤细胞PD-L1的表达（对肿瘤细胞免疫逃避起重要作用）受EMT信号转导途径（即miR-200/ZEB1信号轴）的上调。此外，EMT有助于肿瘤相关巨噬细胞的募集，进一步发挥这一途径的免疫抑制作用，抑制EMT可能是一种提高免疫治疗疗效的有效策略。还有一项针对慢性淋巴细胞性白血病患者的临床试验使用了一种AXL激酶抑制剂TP-0903，这种抑制剂先前已经被证明可以抑制EMT（NCT03572634）。
截至2019年，已有50多项临床试验间接或直接与靶向EMT有关，而达标的则要少得多。鉴于先前的证据表明，至少在某些情况下，MET是转移性生长所必需的，
令人惊讶的是，抑制MET这一策略没有得到更多的关注。例如，在肿瘤已经转移的情况下，使用EMT抑制剂（可能促进MET）治疗可能对原发或循环中的癌细胞有害，但同时使转移细胞受益。
尽管在技术上具有挑战性，但理想的治疗策略可能是使用EMT抑制剂靶向原发肿瘤和CTC，同时也选择性地使用MET抑制剂靶向转移性肿瘤。未来在检测微转移和靶向给药方面的进展有可能使这种策略变得可行。同时，需要更彻底地了解EMT-MET谱中不同状态的细胞对当前疗法的反应。
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