类器官的常用检测方法和操作流程

类器官作为目前常用的3D细胞培养手段，广泛应用于科研界和工业界。STEMCELL往期推送过很多关于类器官的培养技巧、操作视频等等，很多同学还反馈希望能够系统的了解和学习目前使用类器官可以进行的常用实验方法有哪些。今天小编给大家总结了相关内容，并提供有相关的实验操作流程，供大家参考。

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培养部分

肠类器官的建立和培养

点击这里查看“使用IntestiCult™类器官生长培养基（小鼠）进行小鼠小肠类器官建立”的完整实验流程，包括IntestiCult™类器官生长培养基的制备及小肠组织处理的完整操作过程。另外，我们在“如何提高肠类器官的构建效率”这篇文章中还总结了在肠类器官培养中的关键步骤，并配有动图进行解释，希望能够帮助大家提高实验成功率。

肠类器官的传代与冻存

类器官建立完成后，需要定期对其进行传代，以维持类器官的扩增和细胞活力，另外，可对类器官进行冻存留待后用，点击“如何进行小鼠肠类器官的传代和冻存“查看完整实验流程，另外我们还总结了使用IntestiCult™类器官生长培养基中常见的问题及对应的解决方法。

如何建立癌症组织来源的类器官？

除了从健康组织中构建类器官，从病人来源的癌症样本中构建类器官（Patient derived organoid, PDO）也是近年来大热的癌症建模的方法，点击”如何建立癌症组织来源的类器官“查看我们总结的完整实验流程。该操作流程与Hubrecht Organoid Technology合作开发，用于在 IntestiCult™培养Wnt信号通路发生突变的结肠癌类器官。

如何进行肝/胰腺类器官的培养？

肝祖细胞类器官和胰外分泌腺的培养方法方法极为类似，点击”小鼠肝祖细胞类器官的培养方法“查看如何从小鼠肝组织中分离出肝导管片段，如何通过Corning® Matrigel®dome（凝固液滴）培养肝祖细胞类器官，以及如何对类器官进行团块传代；点击”小鼠胰腺外分泌类器官的培养方法“查看如何用于从小鼠胰腺组织中分离出胰管片段，如何通过Corning®Matrigel® dome培养胰腺外分泌类器官，以及如何对类器官进行团块传代。

如何从多能干细胞培养体系建立脑类器官？

点击”神经类器官操作流程“查看关于从多能干细胞构建脑类器官的完整实验方案，内容包括如何从人多能干细胞生成脑类器官的详细操作步骤，类胚体的形成、神经诱导、神经上皮扩张和类器官的成熟。

从3D类器官建立2D肠上皮模型

肠类器官的封闭腔室结构不适用于某些特定的实验研究，造成了它的局限性。单层肠上皮培养体系具有外露的单层上皮的顶面，从而适合多种研究，比如，研究顶端细胞表面受体、与共生或病原微生物的相互作用、模拟肠内容物中潜在的有益或有害物质的作用。

单层肠上皮培养体系可培养在玻璃盖玻片上以实现高质量图形成像，也可以培养在Transwell®上以检测物质穿过上皮层的主动和被动运输，和电荷屏障功能性检测。单层培养物可以通过不同培养器皿建立，以灵活适应不同培养体系。点击'从肠类器官建立单层肠上皮培养体系'查看如何使用建立好的稳定扩增的肠类器官建立单层肠上皮培养体系的方法。

类器官线上培训中心

我们的类器官操作培训全长共2个半小时，包括一场关于肠类器官背景知识及应用的课程、四场关于肠类器官上手操作的实验过程，包括复苏、培养、传代、冻存及不同时间的形态观察，点击这里或下图进入我们的线上培训中心。

染色部分

冰冻切片染色

对类器官进行冰冻切片染色是用来检测目标标志物表达水平或分布的常用手段，点击”类器官荧光染色实验流程“查看如何对肠类器官/肝类器官/胰腺外分泌类器官等cystic organoid进行冰冻切片和应该染色的方法。

而对于脑类器官，由于其具有更加复杂的3D结构，STEMCELL单独推出了针对了对成熟的脑类器官进行冷冻切片和免疫荧光染色，并降低对组织伤害与保留关键抗原表位的方法，点击“脑类器官的冷冻切片和荧光染色”进行阅读。

全组织染色

在对cystic organoid进行冰冻切片的过程中，有很多同学反映不容易找到类器官或不容易找到类器官的合适位置，也可以考虑采用whole-mount staining的方法进行染色，其中Nature Protocol也发表过相关的Protocol，可点击这里查看，另外STEMCELL也提供相关的实验流程，请点击”Whole Mount ImmunoStaining of Organoids“进行申请。

对在Transwell或96孔板中培养的上皮细胞进行荧光染色

上文提到过，为针对单层上皮的顶面进行treatment，可将3D结构的类器官转化为单层上皮的培养体系；另外，人上皮细胞的气液界面（ALI）模型系统，越来越多的被用于在体外研究人类健康和疾病。通过去除细胞顶端（apical）表面的培养基，气道和胃肠来源的细胞可进行进一步的分化，培养条件更接近于体内环境，更具有生理相关性。

点击”对在Transwell中培养的上皮细胞进行荧光染色“查看在Transwell® inserts上培养的ALI或单层培养体系的whole-mount ICC染色，包括原代细胞、多能干细胞或细胞系来源的培养体系。

RNA或蛋白水平检测

类器官也可通过qPCR或western blot的常规实验方法检测其RNA或目标蛋白的表达水平，可使用冷的PBS进行吹打或加入溶解基质胶的试剂破坏基质胶后进行提取。从小鼠小肠类器官提取RNA常见问题是较低的回收率，我们发现使用200 - 500个类器官进行RNA提取较佳，大概是从正常培养的24孔板中收集2 - 3孔的数量。请点击”Organoid RNA extraction protocol“获取STEMCELL为您提供的Protocol。

功能检测

细胞活力检测

Cell viablity assay是使用类器官进行药敏检测的常用手段，对类器官进行活力测定可在96孔板中进行，如使用CellTiter-Glo® 3D进行定量检测。点击”Development of a 96-well Assay for Assessing Cell Viability in Mouse Small Intestinal-Derived Organoids after Treatment with Cytotoxic Compounds“可查看详细的操作流程，供大家参考，我们使用了小鼠小肠类器官在96孔板中检测了伊利替康（Irinotecan）、5-Fluorouracil（5-FU）Flavopiridol和Loperamide四种药物在24h - 72h的IC50值。另外，也可以使用检测胞内ATP荧光信号的方法对其进行细胞活力定量分析。

Forskolin Assay

将肠类器官培养中加入forskolin会导致细胞cAMP（cyclic adenosine monophosphate）的水平急速上升，促进CFTR通道张开。当氯离子穿过通 道进入内腔后，类器官将会由于水渗透量（osmosis）的增加而不断肿胀。 通过这个原理，我们可以对CFTR的活性的进行试验。类器官肿胀与CFTR 的活性有关，CFTR野生型的类器官在经过forskolin处理后体积将增大，而携带CFTR突变或使用CFTR抑制剂的类器官体积将不会变化。

点击”Forskolin诱导培养于IntestiCult™中人肠类器官膨胀的操作流程“查看使用Forskolin诱导源自健康人供体培养在IntestiCult™类器官生长培养基（人）的结直肠类器官的操作流程。

下游实验

对类器官进行基因组编辑

将CRISPR-Cas9和类器官相结合，可以让研究人员开发出更多生理相关的体外人类疾病模型，研究器官发育。点击”使用CRISPR-Cas9技术对人肠器官进行基因组编辑“查看下对在IntestiCult™类器官生长培养基（人）中培养的人肠类器官进行CRISPR-Cas9基因组编辑的操作流程，使用ArciTect™CRISPR-Cas9核糖核蛋白（RNP）为基础的系统和STEMCELL的Guide RNA Design Tool。

与免疫细胞共培养

将类器官与其它种类的细胞进行共培养是近年来大热的研究方向，包括免疫细胞、肿瘤细胞、肠道细胞、间充质细胞等等。在类器官共培养中，肿瘤类器官与免疫细胞的共培养的关注度是最高的。2019年，Nature protocol上发表了关于肿瘤类器官和T细胞共培养的protocol，使用肿瘤类器官和自体外周血共培养体系对肿瘤反应T细胞（tumor-reactive T cells）进行了功能性评估。

肿瘤类器官可与不同免疫细胞（包括TILs，CAR-T或特定TME的组分）进行共培养，使用ELISA，FACS或形态学变化对免疫治疗进行评价（如下图所示），包括：

• 利用特定条件下的非自体的异源T细胞（non-autologous allogenic T cell assays）共培养实验，评估免疫疗法的有效性。

• 评估异源T细胞和CAR-T细胞对肿瘤类器官的杀伤效率，来测试细胞毒性作用（ADCC）和细胞吞噬效应（ADCP）。

• 评价CAR-T和TCR细胞的肿瘤应答效率。

• 对肿瘤类器官上的免疫治疗靶基因水平进行剖析，或确定目标抗原（如肿瘤相关抗原、免疫检查点分子）。