长链非编码RNA(long nocoding RNA, lncRNA)不编码蛋白,但以RNA形式在表观遗传、转录及转录后等层面调控基因的表达水平。高通量lncRNA检测无外乎基因芯片(SBC lncRNA array)和二代测序,但是,当你做完高通量检测,RT-PCR工作就要开始了。那么,问题来了,lncRNA定量验证,与mRNA验证,有什么异同点呢?
1、选择信号值较高的探针,优先选择Flag为P(若组间差异大,可选择一组为P,另一组为A),信号值大于7(原始信号值27=128)的探针数据进行验证。
2、设计引物位于探针序列附近, PCR扩增产物序列最好包含芯片上探针的序列。
3、引物设计出来后要对引物扩增效果进行验证,确保引物的溶解曲线良好,扩增Ct值在20-25之间。
4、用于芯片结果验证的样本最好与用于芯片实验的样本为同一样本,以保证芯片结果与定量结果的一致性。
不了解详情的小伙伴们请翻阅上一篇:实用技巧贴(一):表达谱芯片定量验证引物设计
差异点 1 lncRNA序列的获得 基于芯片的lncRNA检测都是从各大数据库整合而来,因此,可以根据数据结果中的Accession号在相应的数据库中进行lncRNA序列查找。
B.lncipedia (http://www.lncipedia.org/):
序列详情:
C.NONCODE(http://www.noncode.org/):
D.lncrnadb(http://www.lncrnadb.org/):
E. ENSEMBL_GENCODE(http://asia.ensembl.org/index.html):
由于lncRNA从基因组来源的不同,其序列也有不同特点,特别是“exonic_sense”类lncRNA,其来源与mRNA外显子的一部分。因此,在引物设计时一定将lncRNA与mRNA区分开来。如lncRNA----AC051649.12(绿色),和LSP1(蓝色)基因有外显子重叠部分(APTR第二个外显子和LSP1第二个外显子重叠,红色框标注):
因此,对AC051649.12引物设计时,扩增产物应避免和LSP1的重叠部分,选择第一个外显子区域进行验证。
lncRNA的RT-PCR验证也是高通量检测后必须要做的,总得来说,设计策略和mRNA没有本质上的区别,主要的差异有两点,一是lncRNA的序列获得相比mRNA,得去特异性地寻找;二是lncRNA引物设计时,一定要注意验证的区段没有和mRNA重合。注意了这两个问题,lncRNA的验证工作也就迎刃而解了。
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