2017实用技巧贴（二）：lncRNA定量验证引物设计

长链非编码RNA(long nocoding RNA, lncRNA)不编码蛋白，但以RNA形式在表观遗传、转录及转录后等层面调控基因的表达水平。高通量lncRNA检测无外乎基因芯片（SBC lncRNA array）和二代测序，但是，当你做完高通量检测，RT-PCR工作就要开始了。那么，问题来了，lncRNA定量验证，与mRNA验证，有什么异同点呢？

相同点

1、选择信号值较高的探针，优先选择Flag为P（若组间差异大，可选择一组为P，另一组为A），信号值大于7（原始信号值27=128）的探针数据进行验证。

2、设计引物位于探针序列附近， PCR扩增产物序列最好包含芯片上探针的序列。

3、引物设计出来后要对引物扩增效果进行验证，确保引物的溶解曲线良好，扩增Ct值在20-25之间。

4、用于芯片结果验证的样本最好与用于芯片实验的样本为同一样本，以保证芯片结果与定量结果的一致性。

不了解详情的小伙伴们请翻阅上一篇：实用技巧贴（一）：表达谱芯片定量验证引物设计

差异点

1

lncRNA序列的获得

基于芯片的lncRNA检测都是从各大数据库整合而来，因此，可以根据数据结果中的Accession号在相应的数据库中进行lncRNA序列查找。   

常用数据库中lncRNA序列查找:

A．RefSeq（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/），和常规mRNA序列查找没什么区别。

B．lncipedia (http://www.lncipedia.org/):

序列详情：

C．NONCODE（http://www.noncode.org/）：

D．lncrnadb（http://www.lncrnadb.org/）:

E. ENSEMBL_GENCODE（http://asia.ensembl.org/index.html）：

2

引物设计序列的选择

由于lncRNA从基因组来源的不同，其序列也有不同特点，特别是“exonic_sense”类lncRNA，其来源与mRNA外显子的一部分。因此，在引物设计时一定将lncRNA与mRNA区分开来。如lncRNA----AC051649.12（绿色），和LSP1（蓝色）基因有外显子重叠部分(APTR第二个外显子和LSP1第二个外显子重叠，红色框标注)：

因此，对AC051649.12引物设计时，扩增产物应避免和LSP1的重叠部分，选择第一个外显子区域进行验证。

结束语

lncRNA的RT-PCR验证也是高通量检测后必须要做的，总得来说，设计策略和mRNA没有本质上的区别，主要的差异有两点，一是lncRNA的序列获得相比mRNA，得去特异性地寻找；二是lncRNA引物设计时，一定要注意验证的区段没有和mRNA重合。注意了这两个问题，lncRNA的验证工作也就迎刃而解了。

2017实用技巧贴（一）：表达谱芯片定量验证引物设计

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