香菇多糖的抗抑郁作用及其对谷氨酸AMPA受体功能的影响

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功效：抗抑郁

机理：

香茹多糖（Lentinan，LNT）通过增强大脑前额叶（PFC）谷氨酸AMPA受体突触可塑性，在小鼠抑郁模型中表现出抗抑郁作用。

模型：行为绝望模型小鼠

指标：

1、对模型小鼠悬尾试验（TST）的影响；

2、对模型小鼠矿场实验（OFT）的影响；

3、对模型小鼠强迫游泳实验（FST）的影响；

4、对模型小鼠小鼠前额叶中AMPA受体GluR1S845磷酸化水平的影响；

5、AMPA受体特异性招抗剂GYKI52466对LNT抗抑郁效果的影响。

活性成分：香菇多糖

依据：

1、谷氨酸是哺乳动物中枢神经系统中最重要的兴奋性神经递质，脑内大约60%的神经元利用谷氨酸作为主要的神经递质，其在脑组织内的浓度大约是8-10mmol/kg，显著高于单胺类递质。现在已经知道，前脑中使用兴奋性氨基酸的神经元占30%，并且皮质中含有高密度接收谷氨酸作用的神经元，同样，谷氨酸能神经元也丰富的存在与皮质下结构，如海马、尾状核、丘脑和小脑中。谷氨酸系统的生理功能包括记忆认知、神经营养及诱导神经元重塑等。基于药理学和电生物学的特征，谷氨酸受体分为离子型和代谢性两大类。离子型受体分为N-甲基-D-天门冬氨酸（N-methyl-D-asparteta，NMDA）受体，ａ－氨基径甲基恶挫丙酸（α-amino-3hydroxy-5methyl-4-isox-azolepropionicacid，AMPA）受体以及红藻氨基酸（kainate）受体。越来越多的证据表明，人体的谷氨酸系统或许是研究抑郁症病理生理和治疗抑郁症的关键。临床证据表明，抑郁症患者大脑中的AMPA受体，特别是GluR1的表达明显降低。AMPA受体介导中枢神经系统快速兴奋性突触传递，在突触后膜的动态表达与长时程增强、长时程抑制的诱发和维持有关，参与调节学习记忆活动。AMPA受体介导快速的突触传递，是神经系统传导兴奋性的主要驱动力。研究发现，增加AMPA受体活性可以缩短行为绝望模型大鼠在强迫游泳中的不动时间。AMPA受体亚基GluR1的运输和突触可塑性都是由GluR1磷酸化调控的。用传统抗抑郁药物氟西汀和噻奈普汀处理的小鼠，大脑中GluR1Ser845（S845）磯酸化水平增加。

2、香菇是最广泛的食用菌之一，其有效活性成分是LNT，LNT是β-（1-3）-Ｄ-葡聚糖为主链，β-（1-3）-葡萄糖为侧链的葡聚糖。LNT因其强大的防癌抗癌作用被人熟知，在1969年由Chihara等人报道。他们将肉瘤180癌细胞移植到CD-1小鼠体内，发现LNT能够抑制癌细胞的生长。随后，研究者发现分子量从40到60×104的香菇多糖有着不同生物活性，包括抗炎、抗癌和免疫调节活性。LNT能够刺激免疫细胞的分化、增殖和成熟，改善机体内环境稳态，能恢复或者增加激素、淋巴因子及其他生物活性分子的反应性作用。LNT对肺癌、胃癌、乳腺癌、肝癌、血液系统癌症等癌症都有一定的抑制效果。LNT具有双链核糖核酸，可诱导产生干扰素，具抗病毒能力，对HBV、HIV、流感病毒等均有一定的拮抗作用。此外，LNT还具有降血糖、抗衰老、抗氧化等生物学作用。最近的研究表明，LNT在慢性应激模型中表现出抗抑郁作用，小鼠在FST中不动时间显著减少。

【实验】

1  实验材料

1.1 动物

所有的动物实验经过云南大学医学院医学伦理委员会批准，并遵循实验动物护理和使用指南（ISBN0-309=05377-3）。雄性CD-1小鼠，6周大，体重范围为22-26ｇ，SPF级，购于北京维通利华实验动物技术有限公司。动物购进后分装在笼子里，自由进食，每天早上９点开灯，晚上９点关好，动物房温度恒定（22±3℃），相对为湿度（55±10%），进行１周适应性喂养。1周适应期过后，给小鼠用药，将药物或生理盐水按体重（10μl/g）腹腔注射，注射和检测的时间在上午９点至12点之间。

1.2 分组给药

为了测试LNT的抗抑郁效果，设置了五个处理组：生理盐水（0.9%氯化钠），低剂量LNT（5mg/kg，溶解在生理盐水中），中剂量LNT（12.5mg/kg，溶解在生理盐水中），高剂量LNT（20mg/kg，溶解在生理盐水中），和丙味嗦（15mg/kg，溶解在生理盐水中）。药物注射１天后进行动物行为学检测，第１天进行TST，第４天进行OFT，第５天进行FST。为了验证LNT的抗抑郁作用，另一批的小鼠在同样的条件下，第１天进行FST，第５天进行TST。

2  实验方法

2.1 悬尾实验

本研究中的TST参照Cryan等人设置的程序执行。用长7cm、宽2cm的胶带将小鼠的尾己固定住，小鼠头部向下悬挂，尾梢露出2mm。在实验没有观察到有小鼠攀爬它们的尾巴。每只小鼠单独悬挂在30cm高的台面出，用录像设备录下6min的试验阶段。让一个没有动物行为学实验经验的观察者观看录像并记下小鼠在绝望阶段（即除去开始2min剩下的4min内）的不动时间。

2.2 矿场试验

OFT是一种常用的小鼠行为学实验，是检验动物在新的环境中的自发性探索行为及焦虑的一种方法。其原理是根据一方面动物本能地会害怕空旷场地，会表现出趋避性；另一方面，对于新的场所，动物也会充满好奇也地去探索。OFT被广泛应用在神经学与精神药理学研究中，一般用来检测药物的副作用。本研究中，活动室长宽高为60cmｘ60cmｘ30cm，地板为黑色，用白线平均分割成16个面积为15cmｘ15cm的正方形。用OFT来研究LNT是否诱导机体产生运动机能亢进。连续４天腹腔注射药物后，将小鼠放置在活动室的中央，记录小鼠行为60min。用ANY-maze分析系统分析小鼠在活动室中移动的总距离和小鼠在中央区域（活动室中心的４个正方形）移动的总距离。

2.3 强迫游泳实验

FST是参照一个广泛使用的程序进行。将小鼠放置在一个直径为20cm的圆缸内，水深度为20cm，水温23±1℃。用录像设备录下6min的试验阶段。实验结束，将小鼠从水中取出，用纸巾擦干，放回笼内。让一个没有动物行为学实验经验的观察者观看录像并记录下小鼠在绝望阶段（即除去开始2min剩下的4min内）的不动时间。

2.4 蛋白测定

小鼠断颈处死，剪开头皮、头骨，迅速取出前额叶，放入1.5mlEP管中，迅速放进液氮中，稍后放入-80℃的冰箱中储存备用。取前额叶组织，加入500μl的裂解液，研磨，冰浴30min。然后用低温超速离心机离心，设置温度为4℃，转速为14000rpm离心10min。取上清液，测定其中的蛋白浓度。

3 结果

3.1 注射１天LNT在小鼠TST和FST中表现出显著抗抑郁作用

TST数据表明，LNT处理组的不动时间明显低于阴性对照组（108.30±9.34sec），并且表现出剂量依赖：低剂量组不动时间为75.82±10.47sec，中剂量组不动时间为61.27±11.59sec，高剂量组的不动时间为63.36±12.34sec（图二Ａ）。丙咪嗪处理的阳性对照组同样表现出抗抑郁效果，小鼠不动时间为52.09±11.77sec（图二Ａ）。FST数据表明，LNT处理１天后，３种剂量都表现出强烈的抗抑郁效果，与阴性对照沮107.50±14.08sec的不动时间相比，低剂量组不动时间为56.67±8.95sec，中剂量组不动时间为48.00±11.81sec，高剂量组的不动时间为42.67±11.84sec（图二Ｂ）。同样地，丙咪嗪也表现出抗抑郁作用，不动时间为51.33±10.02sec（图二Ｂ）。

3.2 连续注射５天LNT在小鼠TST和FST中表现出显著抗抑郁作用

TST数据表明，LNT处理组小鼠的不动时间明显低于阴性对照组（116.00±12.51sec），并且表现出剂量依赖：低剂量组不动时间为65.43±11.17sec，中剂量组不动时间为62.00±15.23sec，高剂量组的不动时间为61.71±7.71sec（图三Ａ）。丙咪嗪处理的阳性对照组同样表现出抗抑郁效果，小鼠不动时间为59.88±14.40sec（图三Ａ）。FST数据表明，LNT处理５天后，巧中剂量都表现出强烈的抗抑郁效果，与阴性对照组123.60±18.21sec的不动时间相比，低剂量组不动时间为61.25±12.21sec，中剂量组不动时间为57.43±19.34sec，高剂量组的不动时间为54.71±12.22sec（图三Ｂ）。同样地，丙咪嗪也表现出抗抑郁作用，不动时间为56.29±23.20sec（图三Ｂ）。

3.3 连续注射4天LNT在小鼠OFT中未表现出运动机能亢进

LNT处理组和对照组对比，小鼠移动的总距离没有明显的不同，表明LNT不会引起小鼠运动机能亢进（图四Ａ）。小鼠在中央区域移动的总距离在LNT处理组和对照组对比看来，也没有什么不同（图四Ｂ）。实验进行５天后，不同处理组小鼠的体重也没有显著差异（图四Ｃ）。

3.4 连续治疗５天，LNT增强了小鼠前额叶中AMPA受体GluR1S845磷酸化水平

为了明确LNT对AMPA受体的作用，LNT处理５天后用westernblot分析小鼠前额叶中蛋白水平，发现LNT处理组GluR1S845的磷酸化水平增加了。LNT低剂量组5mg/kg，LNT中剂量组12.5mg/kg和LNT高剂量组20mg/kg的相对蛋白表达分别是137.60±12.02％，134.08±4.70％和133.20±4.42％，和阳性对照丙咪嗪的131.50±4.43％相似（图五Ａ）。丙咪嗦的结果和Du等人的发现一致。不同的处理组，小鼠前额叶中总GluR1蛋白水平保持不变（图五Ｂ）。

3.5 AMPA受体特异性招抗剂GYKI52466对LNT抗抑郁效果的影响

CD-1小鼠腹腔注射，按体重给药，设置４个处理组：阴性对照生理盐水组，GYKI组，LNT＋GYKI组和LNT组。LNT使用中间剂量12.5mg/kg，连续注射两天。LNT＋GYKI组是在第二天注射LNT60min后，按照15mg/kg的剂量给小鼠注射GYKI52466，30min后进行行为学实验TST。在TST试验中，GYKI52466完全阻断了由LNT引起的小鼠的静止不动时间的减少：阴性对照生理盐水组，小鼠的静止不动时间为128.40±16.72sec；GYKI组，146.90±14.75sec；LNT＋GYKI组，116.60±6.78sec；LNT组，69.50±9.53sec（图六）。结果表明，LNT发挥抗抑郁作用的机制或许是增强突触中AMPA受体的兴奋性。

4 结论

LNT具有免疫调节活性，己经有研究表明LNT可以结合β-葡聚糖受体，如CD11b，dentin-1，和巨隨细胞和单核细胞中toll样受体２（TLR2）。研究表明，在大鼠和人脑内皮细胞中，TLR2，TLR3，TLR4和TLR6的表达在血脑屏障（BBB）的调节中发挥着重要作用。已有研究发现在抑郁症患者中，脑部前额叶的AMPA受体GluR1的水平降低，这表明AMPA受体信号传导在PFC的重要性。GluR1磷酸化发生在S845位点，S845位点是蛋白激酶Ａ作用位点，通常被视为神经元中膜插入和通道口打开的指示器。在我们的实验中，连续注射LNT5天后，前额叶中GluR1S845磷酸化水平显著増强（图五Ａ），这表明増强AMPA受体信号与LNT的抗抑郁机制相关。在本实验中，我们发现，AMPA措抗剂GYKI52466能够阻断LNT介导的抗抑郁作用，这表明提高AMPA突触传递是LNT发挥抗抑郁作用的关键。