做完16S多样性或宏基因组测序后，想找出组间的差异物种或功能，该如何去实现呢？今天就给大家分享一种简单好用，而且输出图片能直接用于发文章的软件-STAMP。
STAMP始于2014年，短短一年里就已经风靡全球。究其原因是STAMP能够分析两组甚至是多组样本之间的差异COG、KEGG，以及任何分类水平的物种等，而且操作便捷，每种图形都基本能直接用于发文章，因此广受欢迎也是必然的事儿。
那今天我们就来一步一步学STAMP吧！
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STAMP（STatistical Analysis of Metagenomic Profiles）是用于分析分类或代谢图谱的软件包。
在微生物多样性分析中，STAMP常用于比较多组样本（ANOVA分析）、两组样本 （ Welch’s t-test分析）或两个样本 （Fisher’s exact test分析）之间物种的丰度差异情况，通过此分析可获得显著性差异物种，故业内称STAMP分析 为STAMP差异分析。当然，美吉也提供好几种展示差异的分析，如： LEfSe分析、Wilcoxon秩和检验分析云云。那今天为何给大家分享STAMP软件呢？因为你能将它down到自己的pc里，并且随意（姑且这么说吧）进行感兴趣的分析；此外，STAMP对样本数没有要求。
进入STAMP官网 http://kiwi.cs.dal.ca/Software/STAMP，通过Downloads选择需要下载的安装包；在安装新版本前，请先卸载旧版本。当然，各位在其官网中也能下载它的源代码。
辣么，STAMP安装OK后……什么？安装不OK？
淡定！淡定！检查一下你的安装路径中是否有中文（STAMP安装路径中不能含有中文）。
准备停当，终于可以开始啦！打开STAMP，映入眼帘的就是如下图的展示界面（不同版本界面排布方式略有差异）:
界面主要分三部分，左侧区域是工具栏窗口，中间为图形展示区，右侧是计算后的数据表格显示区。
好了，终于可以进行分析了。打开软件，输入原始文件……
原始文件是啥？长什么模样？
原始输入文件需要两个，而且，存放输入文件的路径中也不能含有中文字符。STAMP支持多种格式文件（MG-RAST、BIOM、RITA、mothur、CoMet）输入，当然也支持多种格式文件输出。本文示例以BIOM格式文件为第一个输入文件，第二个为分组文件，分组文件需以电脑Tab键分隔，加表头，并存为文本格式（.txt）。如下图，第一列是样本名，第二列为分组名，与美吉云平台分组文件格式要求相同哟！
首先按如下路径将BIOM格式输入文件转化为用于STAMP分析的*.spf格式文件，其中文件不能含有中文字符：
File→Creat STAMP profile from...→BIOM profile→Load→Create STAMP profile
接下来导入上一步生成*.spf文件以及之前准备好的分组文件进行绘图。
路径：
File→Load data...→OK
值得一提的是，看官们必须先确定此次分析的是多组样本（Multiple groups）、两组样本（Two groups）还是两个样本（Two samples），然后选择适当的分析方法。下图红框内为选择分析方法的窗口，每一种分析对应不同的算法。本文示例为两个样本的Fisher’s exact test分析。
眼神犀利的看官们会发现这个面板上还有Multiple test correction这个选项，它是用来干嘛的呢？在统计学中，当进行多次假设检验时小概率被积累变大，即犯错的概率升高，因此需要对p值进行多重假设检验校正。如下图这里的q-value filter中的q，即校正以后的p值。STAMP中可选择BH、 Bonferroni、Sidak和storey FDR校正方法，也可以调整q-value filter阈值，默认0.05；以及置信区间的阈值，默认0.95。
加载中……加载中……加载中……（实际上很快就能出图）
这时，图形界面可能就有图片展示了。
咬文嚼字的看官会问：为什么还“可能”啊，神神秘秘的。
Muji，muji，待我说明一下：当进行两组或者多组分析时，若组间不存在差异物种，或许就没有图片了。
如下图所示，左图所示为不同物种在两个样本中的丰度比例，中间所示为95%置信度区间内，物种丰度的差异比例，最右边的值为p值，p <><>
说了这么多，最后生成的结果该如何输出呢？有办法！点击“file”-“save plot”，PNG、PDF、PVG等多种输出格式任您选。
如上，小美简单地介绍了STAMP的简单使用方法及结果解读，关于STAMP的更多详细操作及原理，看官们可以进入STAMP官网 （http://kiwi.cs.dal.ca/Software/STAMP）一探究竟。另外STAMP其实还可以用于作PCA、Scatter plot、Heatmap等微生物群落分析中的常用图形。想必各位看官早已摩拳擦掌、“跃跃欲试”了，那赶紧下载STAMP来尝试一把吧！
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