转录组测序应用之：植物免疫研究

免疫是机体维持健康的重要机制。有别于动物直接在血液中产生免疫反应，植物由于没有完善的循环系统，植物免疫系统的基础是植物的每个细胞。

经典的植物免疫系统包含PTI(PAMP-triggered immunity)，ETS(Eeffector-triggered susceptibility)和ETI(Effector-triggered immune)三个过程。第一阶段，植物的模式识别受体(pattern-recognition receptors, PRRs)通过识别病原体上的一些共有的、保守的分子基序(pathogen associated molecular patterns, PMAPs)从而触发的植物免疫反应；第二阶段，病原向植物内注射效应因子(Effector)抑制植物PTI使病原能够在植物细胞内繁殖；第三阶段，植物通过NBS-LRR(nucleotide binding site-leucine rich repeat)基因来对抗病原Effector，引起一系列级联反应，最终阻止病原进一步扩散。

下面我们就通过一篇成功案例（南京农业大学植物保护学院牛冬冬老师最新研究）来了解一下转录组测序在植物免疫研究的应用。

中文名: 蜡样芽胞杆菌AR156诱发的拟南芥对丁香假单胞菌的免疫反应与flg22诱发免疫反应类似

英文名: Bacillus cereus AR156 Activates Defense Responses to Pseudomonas syringae pv. tomato in Arabidopsis thaliana Similarly to flg22

杂志: Molecular Plant-Microbe Interactions, 2018

影响因子: 4.332

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研究背景

flg22是一种研究较多的PAMP，是对细菌运动极其重要的鞭毛蛋白，其N末端包含22个高度保守的氨基酸。FLS2特异识别flg22后激活下游免疫反应，包括激活MAPK信号途径和抗性相关基因表达，ROS，胼胝体沉淀等。已有研究表明，flg22激活的免疫反应受到SA信号通路的正调控JA信号通路的负调控。丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae pv. Tomato, pst)产生的冠菌素(coronatine, COR)可以激活JA信号通路抑制SA信号通路，从而抑制flg22的免疫反应。

该研究组之前的研究发现蜡样芽胞杆菌AR156处理会促进拟南芥对pst的抗性。有趣的是，AR156处理和flg22处理都会抑制PTI重要的信号分子miR398b和miR773。基于此，对AR156激发的PTI反应是否与flg22的作用机理一致，本研究进行了深入的研究。

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材料与方法

1.实验材料：四周的野生型拟南芥苗，分别用5*10∧7 CFU/ml AR156，1 µM flg22和水处理叶片，收集处理24小时后收集叶片提取RNA，每一组设置2个生物学重复，每个生物学重复至少10株苗混样，共测序6个样品。

2.测序方法：转录组测序，测序平台为北京百迈客生物科技有限公司Illumina HiSeqX Ten。

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研究结果

1. 表型分析：AR156诱导植物对抗性

对野生型拟南芥苗分别先用5*107 CFU/ml AR156，1 µM flg22和水处理叶片，再于24小时后接种pst。结果如下图，AR156和flg22处理均减少了病变程度和细菌种群密度，表明AR156和flg22都可以让叶片对pst产生抗性。

图1  AR156处理后的WT拟南芥对Pst有抗性

2.AR156诱导PTI的机制

为研究AR156诱导PTI的分子机制，该研究组比较分析了AR156与flg22处理后的叶片。处理24h后，AR156处理组和flg22处理组均出现明显胼胝体沉淀和H2O2积累现象；同时，PAMP响应的重要基因PR1, FRK1, WRKY22, WRKY29, MPK表达均显著上调。表明AR156和flg22在诱导PTI过程中有明显的一致性。

3.AR156诱导的pst抗性依赖于AGO1和DCL，但不依赖于FLS2，SA, JA和ET

通路

结合突变体qPT-PCR结果、表型研究结果及细菌种群密度结果，研究AR156诱导的pst抗性对重要信号通路和miRNA结合蛋白的依赖性。

如图2A、2B所示，AR156或flg22处理后显著减少了病变的表型和细菌种群密度，但是不同处理在不同材料间没有显著差异；AR156和flg22处理后pst抗性也没有显著差异。由此可见，AR156诱导的pst抗性不依赖于SA-, JA-, and ET介导的信号通路，而FLS2作为flg22的受体，对响应pst是必不可少的。如图3C和3D所示，AR156处理2天后，病变表型显著减少。fls2苗在AR156处理和flg22处理分别处理后，前者病变表型显著减少后者没有。由此可见，AR156诱导的pst抗性不依赖于FLS2通路。

如图3C和3E所示，AR156处理和flg22处理在WT和ler中病变表型显著减少并且细菌种群密度下降100倍，而突变体ago1-27和dcl1-9中病变表型变化和细菌种群密度均无明显变化。由此可见，AR156诱导的pst抗性依赖于AGO1和DCL。

图2  AR156诱导的抗性不依赖于SA，JA，ET，FLS2信号通路，但需要AGO1和DCL蛋白；AR156和flg22诱导的抗性不依赖于SA，JA，ET信号通路

4.AR156和flg22分别调控miRNA的表达起作用

AR156处理和flg22处理后，检测已经报道的与PTI相关的重要miRNA的表达量，除miR398b外，所有miRNA均上调表达miR158a, miR160a, miR167, miR169, miR391, miR393和miR396。鉴于miRNA对下游靶基因有重要调控作用，本研究继续研究了上述miRNA的靶基因表达情况，结果表明miR158a, miR160a, miR167, miR391, miR393和miR396的靶基因显著下调，miR398b和miR773的靶基因显著上调，miR169靶基因处理前后无显著变化。由此可见，AR156处理和flg22处理后均有miRNA调控的基因表达量变化，但两者的通路中参与的miRNA不同。

5.AR156和flg22调控相似的转录模式

为了研究基因的表达模式，本研究也做了转录组测序。flg22, AR156和水处理后24h的样品进行测序。FDR≤0.05且FC≥1为标准筛选1,302个差异表达基因(DEGs)，AR156处理和flg22处理分别有128和1,291个DEGs，共有的为117个，对DEGs的层次聚类分析见图3B。KEGG注释分析表明共有的117个DEGs的 KEGG注释分类大部分信号通路与代谢过程相关，苯丙醇生物合成和苯基丙氨酸代谢通路在植物免疫过程中起重要作用，氨基和核苷糖代谢，半乳糖代谢，戊糖和葡糖醛酸转换，淀粉和蔗糖代谢与植物细胞壁形成有关，如图3C所示。

如图3D所示，用1,302个DEGs 计算AR156处理、flg22处理和水处理两两之间的相关性，结果表明即使AR156处理和flg22处理分别的DEG差别很大，但AR156处理和flg22处理具有较高的一致性(0.76)。

本研究中，用qRT-PCR验证AR156处理和flg22处理中都上调表达的10个基因和都下调表达基因的6个基因的表达量，验证结果与转录组测序结果一致，如图6A和6B 。

图3  flg22, AR156，水(the control)处理24h后转录组测序

研究亮点

1. 本文的实验材料较为丰富，观察了多个重要通路突变体材料的病变表型及细菌种群密度。

2. 转录组数据分析方面，很好地关注和展现了差异表达基因(DEGs)的KEGG注释通路；从整体差异表达的趋势和差异表达注释结果来关注两种处理后转录组层面的响应情况。

3. 对转录组测序结果进行了qRT-PCR。

参考文献

Wang S., Zheng Y., et al. (2018). Bacillus cereus AR156 Activates Defense Responses to Pseudomonas syringae pv. tomato in Arabidopsis thaliana Similarly to flg2. Molecular Plant-Microbe Interactions.

转录调控事业部