【专题集锦】模拟肿瘤免疫微环境的类器官体外模型

肿瘤免疫治疗是通过重新启动并维持肿瘤-免疫循环，恢复机体抗肿瘤免疫反应从而控制与清除肿瘤。免疫疗法一旦起效，持续时间较长，对于部分患者会长期受益。然而，肿瘤免疫治疗的大规模人群盲试成功率通常仅为 10%～20%，其治疗效果在很大程度上取决于肿瘤微环境，因此产生了对模拟肿瘤免疫微环境体外模型的迫切需求。近年来，类器官作为一种三维细胞培养系统，能更好地用于模拟器官组织的发生过程及生理病理状态。本专题主要总结了用于模拟肿瘤免疫微环境的类器官体外模型及其应用。

一、基质胶包被培养法(Submerged matrigel culture)

将肿瘤组织经过物理或酶解分离后，在细胞外基质（Matrigel或BME）中培养类器官，同时分离外源性免疫细胞（通常来源于自体外周血或肿瘤组织），随后与类器官共培养。这种将类器官完全浸没的培养方式不能保留间质细胞，因此需要外源性添加免疫细胞来构建肿瘤微环境。

DOI：10.1016/j.it.2020.06.010 [1]

1. Cell Stem Cell 2017：胰腺肿瘤类器官揭示疾病进展中干细胞微环境的变化

简介：

日本庆应大学Toshiro Sato团队将胰腺导管腺癌(PDAC) 类器官与肿瘤相关成纤维细胞(CAFs)共培养后，结果表明CAFs分泌的Wnt信号蛋白驱动类器官生长。该研究建立了包含39个患者来源的PDAC胰腺肿瘤类器官库，并根据其干细胞微环境对Wnt和R-spondin的依赖性确定了3种功能亚型[2]。

2.  Cancer Discovery 2019：探究胰腺癌中成纤维细胞的两种不同亚型

简介：

冷泉港实验室David A. Tuveson团队将胰腺星状细胞( pancreatic stellate cells，PSCs )与胰腺导管腺癌类器官共培养，鉴定出两个不同的癌症相关成纤维细胞亚群，分别具有肌纤维特征和炎症性特征[2]。胰腺导管腺癌PDAC类器官与CAFs共培养发现肿瘤分泌的配体IL - 1和转化生长因子(TGF ) β分别促进不同的炎性和肌成纤维细胞CAF亚型[3]。

3. BMC Cancer 2018：胰腺癌的三维肿瘤微环境模型

简介：

威斯康星大学Michael A. James团队将患者匹配的CAFs和外周血淋巴细胞( PBLs )与胰腺导管腺癌类器官共培养后，肌成纤维细胞样CAFs被激活、淋巴细胞浸润到基质胶（Matrigel）中并向肿瘤类器官迁移。首次使用肿瘤微环境的原生类器官共培养物，分别代表胰腺肿瘤、基质和免疫成分。该模型有望促进对肿瘤-基质和肿瘤-免疫相互作用的研究，并对评估免疫治疗药物具有价值[4]。

4. Oncotarget 2018：刺猬信号通路诱导胃癌的PD-L1表达和肿瘤细胞增殖

简介：

美国辛辛那提大学Yana Zavros团队将细胞毒性T淋巴细胞( CTL )与小鼠胃肿瘤类器官释放的肿瘤抗原激活的骨髓来源树突状细胞(DC)共培养；在此，受刺激的CTL在抗PD - L1抗体存在的情况下杀死胃肿瘤类器官，证明了将多种免疫细胞与类器官共培养从而模拟肿瘤免疫微环境的模型可以有效研究肿瘤细胞和免疫细胞以及免疫细胞之间的相互作用[5]。

5. Cell 2018: 外周血淋巴细胞与肿瘤类器官共同培养生成肿瘤反应性T细胞

简介：

荷兰癌症研究所Emile E. Voest团队将肿瘤类器官与自体外周血淋巴细胞(PBLs)共培养产生肿瘤反应性T细胞，这个平台提供了一种临床可行的分离肿瘤应答T细胞的方法，同时可以评估不同患者的肿瘤细胞对T细胞介导的免疫反应敏感性[6]。

6. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology 2019：基质胶包被法研究胃癌模型

简介：

目前认为幽门螺杆菌感染是导致胃癌最重要的因素。蒙大拿州立大学Diane Bimczok团队将幽门螺杆菌和从外周血单个核细胞（PBMC）分离出来的树突状细胞共培养。幽门螺杆菌注射到胃类器官后，幽门螺杆菌（绿）/树突状细胞（蓝）胃上皮细胞分泌的趋化因子募集了树突状细胞，随后树突状细胞吞噬了类器官腔内的幽门螺杆菌。这个模型综合了免疫细胞、肿瘤细胞和病原体三部分，具有阐述致癌相互作用的潜力[7]。

二、气液交界培养法（air-liquid interface，ALI）

将含有免疫细胞的肿瘤组织物理切割成组织碎片，在包被胶原蛋白凝胶的transwell中培养。凝胶顶部暴露在空气中，使细胞获得足够的氧气供应；外皿中的培养基扩散到内皿中形成气-液界面。ALI法不仅保留了原始肿瘤的基本遗传学特征，还保留了TME复杂的细胞组成和结构。

DOI：10.1016/j.it.2020.06.010 [1]

1. Cell 2019：重构微环境并模拟免疫检查点阻断过程

简介：

斯坦福大学Lillian Liao团队通过ALI法培养患者来源的肿瘤类器官重现了患者肿瘤免疫微环境。研究者体外培养了来自 100 个患者，28 种不同疾病亚型的肿瘤组织，患者来源类器官（Patient-Derived Organoid, PDOs) 可保留肿瘤组织中固有的纤维基质和免疫组分。通过单细胞免疫分析法证明，该模型保留了原始肿瘤 T 细胞受体谱并成功模拟免疫检查点阻断，对推动个性化免疫治疗起到关键作用[8]。

尽管ALI法为体外免疫TME建模提供了一个整体策略，可以探索多个不同细胞群体之间的相互作用，免疫成分不会持续超过2个月。此外，在该方法中，灌注仍然是一个挑战。

三、微流控芯片法（microfluidic culture）

将肿瘤消化后形成的球状组织与胶原蛋白混合，并接种到微流体培养装置中，即肿瘤细胞与样本中的固有免疫微环境共同培养，形成天然肿瘤微环境（TME）模型。装置中心部分的3D凝胶用来培养肿瘤微球体，培养基由两侧的孔隙进行流通，可实时持续地调节肿瘤类器官所处的液体环境，也可模拟体内依靠血液自然流动的药物递送方式。

DOI：10.1016/j.it.2020.06.010 [1]

1. Cancer Discovery 2018：构建体外肿瘤免疫微环境

简介：

哈佛医学院dana farber癌症研究中心团队利用微流控芯片培养的人源和鼠源肿瘤类器官系统构建了体外肿瘤免疫微环境，可以在基质胶中维持自体的淋巴细胞群（1个月）。类器官球体直径40 ~ 100 μ m。使用肿瘤微球直接灌注芯片，在培养基通道添加PD-1单抗药物，体外验证免疫检查点抑制剂抗肿瘤的作用并开展了联合用药的研究[9]。

2. Cancer Discovery 2019：KRAS驱动的肺癌中免疫检查点阻断机制

简介：

哈佛医学院dana farber癌症研究中心团队通过在培养基中添加T细胞(Jurkat细胞)来分析T细胞对肿瘤球的浸润。致癌性KRAS突变的肺癌仍然是治疗难点，在LKB1缺失的情况下对免疫检查点阻断有抵抗力。本实验的结果揭示了其关键的潜在机制，具有重要的临床治疗意义[10]。

3. Lab On Chip 2021：构建类器官与可灌注微血管网络模型

简介：

麻省理工学院Roger Kamm团队首次将3D肿瘤球嵌入可灌注微血管网络内，开发了一种能够在生理肿瘤微环境中预测药物递送的系统。包埋前，类器官包含一个自衍生的血管网络。包埋后，水凝胶中的血管(红色)和类器官衍生的血管(蓝色)的功能连接可通过'由内而外'或'由外而内'的方式获得。前者依赖于类器官来源的血管向周围ECM的扩张和延伸。后者通过诱导来自胚胎干细胞的血管与类器官衍生的血管连接[11]。

总结

类器官结构包含多种特异性细胞类型，空间结构与其对应肿瘤组织相似。目前已有多种类型的肿瘤建立了成熟的类器官培养方案。随着生理学上建模方式的精确和完善，类器官培养技术可与体外肿瘤免疫微环境技术相结合，维持其多样化的细胞群体和肿瘤结构，为免疫检查点抑制剂的效果评估、免疫疗法的治疗范围扩大以及精准医学与免疫治疗效果的预测提供应用前景。

参考文献

【1】Kanako Y, et al. (2020) Organoid Models of Tumor Immunology. Trends in Immunology, 41, 8.

【2】T. Seino, et al. (2018) Human pancreatic tumor organoids reveal loss of stem cell niche factor dependence during disease progression. Cell Stem Cell, 22 , pp. 454-467

【3】Biffi,G.et al. (2019) IL1-Induced JAK/STAT signaling is antagonized by TGFbeta to shape CAF heterogeneity in pancreatic ductal adenocarcinoma. Cancer Discov. 9 , 282–301

【4】Tsai, S. et al. (2018) Development of primary human pancreatic cancer organoids, matched stromal and immune cells and 3D tumor microenvironment models. BMC Cancer 18, 335

【5】Chakrabarti, J. et al. (2018) Hedgehog signaling induces PD-L1 expression and tumor cell proliferation in gastric cancer. Oncotarget 9, 37439–37457

【6】Dijkstra, K.K. et al. (2018) Generation of tumor-reactive T cells by co-culture of peripheral blood lymphocytes and tumor organoids. Cell 174, 1586–1598

【7】Sebrell, T.A. et al. (2019) A novel gastric spheroid co-culture model reveals chemokine-dependent recruitment of human dendritic cells to the gastric epithelium. Cell Mol. Gastroenterol. Hepatol. 8, 157–171

【8】Neal, J.T. et al. (2018) Organoid modeling of the tumor immune microenvironment. Cell 175, 1972–1988

【9】Jenkins, R.W. et al. (2018) Ex vivo profiling of PD-1 blockade using organotypic tumor spheroids. Cancer Discov. 8, 196–215

【10】Kitajima, S. et al. (2019) Suppression of STING associated with LKB1 loss in KRAS-driven lung cancer. Cancer Discov. 9, 34–45

【11】Shun, Z. et al. (2021) Vascularized organoids on a chip: strategies for engineering organoids with functional vasculature. Lab On a Chip 21, 473.

撰稿人：王子萱

排版：王子萱

审核：熊卓