尽管在体外癌症模型开发方面取得了一定的进展，但仍然缺乏能同时再现肿瘤微环境复杂性及其不同细胞成分和遗传特性的体外癌症模型。近日，来自韩国浦项科技大学的Jinah Jang教授团队进行了3D生物打印血管化肺癌类器官模型进行精确药物评估的相关研究。研究成果以“3D bioprinted vascularized lung cancer organoid models with underlying disease capable of more precise drug evaluation”为题于5月26日发表在《Biofabrication》上。
本文提出了一个先进的血管化肺癌模型，包括患者来源的肺癌器官（LCOs）、肺成纤维细胞和使用3D生物打印技术的可灌注血管。为了更好再现原生肺组织的生化成分，生产了一种猪肺衍生脱细胞外基质（LudECM）水凝胶，为肺癌微环境中的细胞提供物理和生化引导。特发性肺纤维化衍生的肺纤维细胞（iLFs）用来实现类似于实际人类纤维化的纤维化龛。研究表明，它们增加了细胞增殖和具有纤维化LCOs中耐药性相关基因的表达。此外，在LudECM中，有纤维化的LCOs对致敏性靶向抗癌药物的抗性变化明显大于Matrigel。因此，在再现肺部纤维化的血管化肺癌模型中评估药物反应性，有助于确定对伴有纤维化的肺癌患者治疗。此方法还可用于开发靶向疗法或确定伴随纤维化肺癌患者的生物标志物。
1. LudECM水凝胶的生化和物理特性
图1 肺组织衍生脱细胞外基质（LudECM）的制备和表征
组织衍生的脱细胞CM含有多种成分，如纤维蛋白（胶原蛋白和弹性蛋白）、糖蛋白（纤连蛋白和层粘连蛋白）、蛋白多糖和可溶性因子（细胞因子和生长因子）。这些成分可以影响局部细胞的行为，如粘附、增殖、迁移和分化。为了制造基于组织的CM材料，在脱细胞过程中保留和再现组织特异性CM的基本元素很重要，猪组织衍生的脱细胞CM水凝胶已经成为有前景的类器官培养的材料。本文建立了一个猪肺组织脱细胞策略，并开发了LudECM水凝胶，以重现肺组织特异性的ECM组成，可以影响癌症的进展和发展。测定LudECM水凝胶中残留的dsDNA、GAGs和胶原蛋白的含量，发现其平均含量分别为3.1%、109.7%和264.9%。组织学分析结果显示，异体细胞有效去除，而主要的CM成分（如胶原蛋白）在脱细胞过程中被充分保留。由于细胞间连接位置的比例和细胞内/细胞间力的幅度受LudECM的微观结构特征影响，基质微观结构可能参与控制多细胞相互作用和形态发生，并能通过促进氧气、营养物质和代谢物的运输来促进3D细胞培养。凝胶动力学分析表明，LudECM在pH调整的预凝胶状态下，在37℃下30分钟内可靠地凝胶化。因此，具有稳定复合模量的LudECM水凝胶可能是类器官形成、成熟和长期维护的理想选择。
2. LudEM和Matrigel蛋白质组成比较
图2 肺组织衍生ECM水凝胶蛋白组学分析
为确定LudECM是否适合培养LCO和NAO，研究人员将LudECM的蛋白质成分与Matrigel进行了比较和分析。基于质谱蛋白质组分析显示，LudECM和Matrigel中分别有2825和340个蛋白质，其中218个蛋白质在这两种材料中共同存在。排名前十的蛋白质显示：LudECM包括保守的肺部特异性CM成分，与Matrigel的蛋白质组成分不同。第六型胶原蛋白（COLGAI、COL6A2和COL6A3）、纤连蛋白（FN1）、层粘连蛋白-521（LAMAS、LAMB2和LAMC1）、纤维蛋白原（FGA）和基底膜特异性硫酸肝素蛋白多糖核心蛋白（HSPG2）是LudECM中含量最高的前10个蛋白质。相比之下，Matrigel中含量最高的前十个蛋白是层粘连蛋白-111（LAMA1、LAMB1和LAMC1）、FN1、nidogen（NID1）、HSPG2和肌球蛋白。与Matrigel相比，LudECM含有更多的核心母体组和母体组相关蛋白，除去非母体组蛋白，胶原蛋白和糖蛋白分别占LudECM的43.5%和47.2%，而蛋白多糖占LudECM的1.75%。相反，Matrigel中的大多数母体蛋白是糖蛋白，占母体蛋白的97.9%以上，不包括非母体蛋白。基因本体生物过程（GOBP）分析表明，两种材料之间重叠的母体蛋白大多参与了细胞粘附、迁移、分化和ECM-细胞相互作用。LudECM可以比Matrigel更准确反映体内的肺组织微环境。以上结果表明，LudECM的蛋白质组成可能在癌症发展中起作用，包括增殖、侵略性、耐药性和转移。LudECM在进一步研究癌症生物学和开发潜在治疗策略方面具有潜在价值。
3. LudECM中培养的LCOs组织病理学和分子特征
图3 评估LudECM作为LCOs培养基的适用性
反映患者肿瘤生物学的患者来源的LCOs用作药物开发和精准癌症治疗的工具，以预测对靶向治疗的反应性。为了证实LudECM水凝胶中特定CM信号可以提供一个类似于体内的微环境，有利于COs的发展。将从肺癌患者腹水提取物中建立的LCOs封装在LudECM中进行培养。在LudECM中封装后，LCOs的增殖速度比Matrigel稍慢，但4天后迅速增殖，LCOs在Matrigel中的增殖率在培养的第7天后下降，但在LudECM中的增殖率持续增加，直到培养的第14天，在LudECM上生长的LCOs的形态和大小与在Matrigel上生长的相似。并且在LudECM中培养的LCOs的Ki67基因表达水平在7天内急剧增加，并保持到第14天。肺癌细胞的蛋白质表达水平与原癌组织相似。癌细胞标志物，特别是细胞角蛋白7（CK7），在Matrigel和LudECM之间没有明显的差异。这些结果表明，富含肺组织特异性ECM成分的LudECM支持LCOs的生长，同时保留了原始癌症组织的组织学、分子学和基因突变特性。
4. 通过患者来源的LCOs和iLFs之间串联重述TME与纤维化的关系
图4 在LudECM中与iLFs共培养的LCO特性验证
为了再现患者实际纤维化环境，使用从IPF患者身上产生的人类iLFs来模拟细胞衍生的纤维化生态环境。与正常的肺成纤维细胞不同，ILFs的特点是胶原蛋白形成增强，以及细胞因子和生长因子（如IL-6、TGF-B、FGF2等）的产生和分泌增加。此外，iLFs通过上皮细胞和内皮细胞之间复杂的相互作用调节ECM重塑。对在Matrigel和LudECM中培养的iLFs特征（如生存能力、合成胶原蛋白的能力和释放IL-6）进行了比较和评估。发现当iLFs被包裹在Matrigel和LudECM中并进行三维培养时，其生存能力没有差异。然而，形态上存在明显差异。iLFs在LudECM中伸展良好，而iLFs在Matrigel中很少伸展并部分聚集。iLFs产生胶原蛋白的能力是通过量化羟脯氨酸的总量来评估的，羟脯氨酸是胶原蛋白的基本成分。当iLFs被包裹并在每种材料中培养7天后，LudECM中的羟脯氨酸总量增加，而Matrigel中的羟脯氨酸总量没有变化，结果表明LudECM可能比Matrigel为iLFs生产胶原蛋白提供了更有利的信号。LudECM刺激iLFs产生胶原蛋白的能力可能有助于开发一种与Matrigel相似的癌症模型。并且LudECM在增强基质细胞（如成纤维细胞）的增殖方面比Matrigel更有优势。总之，iLFs对LCOs的旁分泌作用可以潜在地影响对癌症发展、进展和耐药性等至关重要的途径。LudECM支持癌症和基质细胞之间密切串联，从而能够在类似于实际癌症微环境条件下进行更精确药物反应评估。
5. 3D生物打印的血管化LCOs模型药物测试反应
图5 3D生物打印血管化肺癌器官模型制造和药物测试
最后，使用TME模拟生物墨水和3D生物打印技术制作了一个血管化的COs模型。基于挤压三维生物打印技术允许同时使用聚合物以及含有两种或更多细胞类型的骨架来制作三维组织模型，模拟多细胞组织的特性和微环境。在重现血管灌注系统、组织-组织界面以及在多细胞水平上的组织特定结构特征方面具有优势，可以将细胞置于设计的形状或所需的位置。为了评估药物在血管化ICOs模型中通过血管的运输，将FITC-葡聚糖注入血管中，并比较其扩散趋势。当ECs和iLFs单独存在时，右旋糖扩散也被打断，特别是当ECs和iLFs一起存在时，右旋糖的扩散发生了明显的干扰。在血管化的LCOs模型中观察到成纤维细胞和LCOs之间的融合现象。Ki67阳性细胞也显示血管化LCOs模型中的增殖细胞数量比非血管化LCOs模型中的增殖细胞数量多。由于开发的血管化肺癌模型是一个高度复杂的组织模型，包含三种类型的细胞：基质细胞、血管细胞和肺癌器官。为此，比较了LCOs-ECs共培养和LCOs-iLFs-ECs三者通过转孔系统培养的LCOs的增殖率。结果，在共培养和三培养条件下，COs的增殖率没有明显差异。血管化的LCOs模型可以为抗癌药物在体内的表现提供有价值的见解。如药物可以被周围基质吸收，或者药物输送可以被癌细胞-间质细胞或癌细胞-基质相互作用打断。在有潜在疾病的癌症中，药物输送尤其具有挑战性。
6. 总结与展望
尽管在癌症治疗方面有很大进步，但癌症仍然是一个严重的全球健康威胁。本文开发了一个包含基质细胞的血管化肺癌模型，以模拟更复杂的TME。反映患者遗传特征的PDO提高药物反应预测的准确性。使用含有肺组织特定细胞外基质成分的LudECM水凝胶开发一种包含病人来源的LCOs的生物墨水。LudECM水凝胶包括胶原蛋白、糖蛋白和与细胞分化、增殖、粘附和迁移有关CM成分的蛋白多糖。在LudECM水凝胶上，呼吸系统衍生的类器官（LCOs和NAOs）显著成长，并与在Matrigel增殖类似。存在纤维化的LCOs模型可以为伴有纤维化的肺癌的复杂生物学提供宝贵的实验基础。3D生物打印高级体外COs模型，它不仅包括构成TME的肺组织特异性ECM成分，还包括LCOs、基质细胞和血管成分。这种方法能够开发出更全面和准确的肺癌模型，反映出病人独特的遗传特征。三维生物打印的体外血管化LCOs模型能够实现癌细胞-基质和癌细胞-基质细胞的相互作用，以评估在类似于实际体内条件下的药物反应。该模型有望应用于新的靶向治疗和生物标志物的发现，并在此研究的基础上进行更深入的研究。
文章来源：
https://iopscience.iop.org/article/10.1088/1758-5090/acd95f
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