Nature Cell biology:AP-1标记衰老细胞的可逆转录程序

2020年6月法国巴黎巴斯德研究所Oliver Bischof教授于Nature Cell Biology上发表文章AP-1 imprints a reversible transcriptional programme of senescent cells，揭示了增强染色质、转录因子募集与衰老能力之间的关系。我们证明激活蛋白1（AP-1）是衰老增强剂领域的先驱，并定义了驱动衰老细胞转录程序的转录因子网络的组织原理。总之，该发现使人类能够操纵衰老表型和潜在的治疗意义。

细胞衰老在胚胎发育、伤口愈合和肿瘤抑制中发挥着重要作用。自相矛盾的是，它也被认为是导致衰老和与年龄有关的疾病，包括癌症和退行性病理学的重要因素。细胞衰老是一种稳定抑制受损和功能失调细胞增殖的细胞命运。最显著的衰老诱导因子是高活性癌基因（癌基因诱导衰老（OIS））和诱导癌细胞衰老的治疗干预（治疗诱导衰老（TIS））。衰老停止伴随着基因表达的广泛变化，包括衰老相关分泌表型（SASP），它涉及炎症细胞因子、生长因子、蛋白酶和其他分子的表达和分泌。作者对衰老的表观遗传机制的认识最近才意识到。然而，对衰老细胞命运的关键基因调控方面仍然知之甚少。增强子是驱动细胞命运转移的关键基因组区域。在哺乳动物细胞中，增强子大致分为两类：活跃的和稳定的。虽然活性增强子的特征是赖氨酸4（H3K4me1）上的组蛋白3甲基化和赖氨酸27（H3K27ac）上的组蛋白3乙酰化同时存在，并且与活性转录基因相关，但稳定的增强子仅由H3K4me1标记，其目标基因通常不表达。增强子的一个子集也可以从没有任何转录因子（TF）结合与组蛋白修饰。最近的研究表明，增强子重塑在驱动衰老相关基因表达中起作用。目前尚不清楚哪些增强因子、表观遗传标记或TFs使细胞能够对衰老诱导信号作出反应。先锋TFs通过允许染色质长期接触非先锋因子，在建立新的细胞命运能力方面至关重要，并且通过开放和授权增强器景观，先锋TFs也是细胞身份的关键决定因素。具有衰老潜能的先驱TFs至今尚未被发现。在这项研究中，作者使用转录组和表观基因组的动态分析来表明，增强子的表观遗传状态预先决定了它们在衰老过程中的顺序激活。作者证明激活蛋白1（AP-1）可以“印记”衰老增强因子，有效地调控与衰老程序及时执行相关的转录活动。定义并验证了一个分层TF网络模型，并证明了该模型在衰老重编程实验设计中的有效性。总之，作者的发现定义了驱动衰老程序的基因调控元件的动态性质和组织原则，并揭示了衰老细胞治疗操作的有希望的途径。

时间分辨转录组和表观基因组谱分析衰老代码

图1 |衰老转录程序的多阶段建立。

作者采用人肺成纤维细胞（WI-38株）进行OIS的时间序列实验三苯氧胺诱导受体：RASV12表达系统7（RAS-OIS）。通过微阵列测定了整体基因表达谱，并通过ATAC-seq（利用测序分析转座酶可及染色质）绘制了可及染色质位点，以推断6个时间点（0（T0）、24、48、72、96和144 h）的TF结合动力学和层次结构。在三个时间点（T0、72和144 h）交联拟用于芯片seq（染色质免疫沉淀，然后进行测序）的细胞，并用于分析组蛋白修饰，包括H3K4me1（假定的增强剂）、H3K4me3（启动剂），H3K27ac（活性增强剂和启动子）和H3K27me3（多克隆抑制染色质）（图1a）。为了进行比较，作者将WI-38细胞（在T0、12、24、48、72和96小时的时间点）通过提取血清进行静置（96小时）。作者在另外两个使用WI-38细胞的衰老模型中验证了作者的方法：（1）致癌的RAF诱导衰老（RAF-OIS；在T0、12、24、48的时间点，转录组和ATAC序列分析为72和96小时，H3K4me1和H3K27ac芯片序列为T0、48和96小时；（2）复制衰老（RS；转录组和ATAC序列分析为T0、144、264、432、624、792、1008和2112小时，H3K4me1和H3K27ac芯片序列分析为T0、264、1008和2112小时），GM21皮肤成纤维细胞RAS-OIS（转录组和ATAC-seq分析时间分别为T0、192和336h）。利用经典衰老相关生物标记物验证了静止和衰老。

衰老转录程序的多阶段建立

为了在WI-38成纤维细胞的整个静止和RAS-OIS时间过程中可视化动态基因表达模式，作者将无监督自组织映射（SOM）机器学习技术（图1b）和多维标度（图1c）应用于作者的转录组数据集。值得注意的是，血清剥夺的成纤维细胞在血清剥夺后24小时内迅速建立了一个静止的特异性基因表达程序，该程序在血清剥夺后略有变化（图1b），主要只参与上调（图1b）和下调（图1b）基因。相比之下，RAS-OIS细胞显示了稳定进化的动态基因表达轨迹，包括上调（红色）和下调（蓝色）的基因表达轨迹（图1b，c），这一点得到了一些衰老相关基因表达谱的证实。接下来，作者计算了转录体的多样性和专一性以及基因特异性。RAS-OIS细胞在转录多样性方面表现出时间进化的增加，而静止细胞表现出时间进化的特异基因表达程序。为了进一步描述RAS-OIS基因表达程序的进化，作者比较了静止和RAS-OIS转录组数据集。共有4986个基因（对应于2931个上调基因和2055个下调基因）受到差异调控在至少一个时间点，并根据衰老表型划分为七个（I—CVII）基因表达模块，具有明显的功能过度表达特征（图1d，e）。RAS-OIS转化过程中高度可重复的基因表达动力学和模块化表明，这一系列细胞状态有高度的预编程，作者在其他衰老模型中证实了这一点；也就是说，WI-38肺成纤维细胞接受RAF-OIS和RS（图1f），以及GM21皮肤成纤维细胞接受RAF-OIS和RS（图1f）RAS-OIS。特别是，细胞周期相关和SASP相关的转录模块在所有衰老模型中高度相似。总之，作者对不同衰老模型中转录组动力学的研究定义了衰老基因表达程序的模块化组织和转录多样性。

一个动态增强程序塑造衰老转录组

图2 |一个动态增强程序塑造衰老转录组。

一个尚未解决的问题是，TFs和表观遗传修饰如何共同塑造一个转录许可的增强子景观，以赋予细胞衰老的潜力。为了回答这个问题，作者首先通过ChIP seq分析组蛋白修饰，并通过ATAC seq分析转座子可及染色质，绘制了RAS-OIS治疗的WI-38成纤维细胞的基因组调控元件。ChromstaR对芯片序列数据的分析确定了RAS-OIS细胞中总共16种染色质状态。大多数基因组（~80%）不考虑时间点，要么没有任何组蛋白修饰分析（~62%）或多克隆抑制（~18%）。由活跃和可接近的染色质状态（即增强子和启动子）代表的基因组比例相对较低（约20%的结合）。染色质状态转换最显著地发生在增强子处，而启动子受到轻微的影响（图2a，b）与先前的结果一致。出乎意料的是，许多增强子在T0-72小时和72-144小时间隔从未标记的染色质中被激活（即获得H3K4me1和H3K27ac）。接下来是更为典型的增强子激活状态从平稳状态（H3K4me1加H3K27ac采集）和增强子平稳状态从无标记和多克隆抑制状态在T0-72小时间隔（H3K4me1采集）（图2a，b）。在接受RAF-OIS和RS的WI-38成纤维细胞中保留了顺序增强子激活的动力学。增强子激活的时间顺序与最近基因的时间表达模式高度一致（图2c）。与此一致，对应分析（CA）（图2d）揭示了基因表达模块（图1d）和染色质状态转换（图2a）之间的强相关性。

接下来作者确定哪些TFs是驱动衰老转录组的动态增强子重塑的关键驱动因子。作者首先将ATAC序列峰与识别出的增强器坐标相交（图2a，b），并进行模体过表示测试。该分析确定了AP-1超家族成员（cJUN、FOS、FOSL1、FOSL2和BATF）和AP-1相关TFs（ATF3以及ETS1）作为任何给定时间点上最丰富的基序。为了排除在增强子处观察到的AP-1 TFs的富集严格依赖于致癌的RAS信号传导，而不是独立于RAS信号传导的增强子景观中特定先锋作用的反映的可能性，作者比较了接受RAS-OIS治疗的WI-38肺成纤维细胞中TF结合位点的ATAC-seq峰，RAF-OIS或RS，在接受RAS-OIS的GM21皮肤成纤维细胞中，在生长因子缺失（因此RAS信号减弱）的WI-38成纤维细胞中。在所有情况下，AP-1基序是富含的主要基序，从而证实了AP-1tfs作为普遍先驱的概念，印证了衰老增强剂景观。

通过采用蛋白质相互作用定量（PIQ）算法，作者进一步分析了作者的时间分辨RAS-OIS ATAC序列数据集。PIQ使TFs的功能层次化成为先驱、定居者和移民。PIQ将TF分为先驱（例如AP-1 TF家族成员）、定居者（例如NFY和NF-ÊB的RELA亚单位）和移民（例如TF RAR家族成员和SREBF1）（图2e）。作者通过检查单个TF足迹的选择以确定其相邻的核小体位置来确认这种TF层次结构。重要的是，如RELA、AP-1成员FOSL2和cJUN所示，PIQ预测和TF芯片序列分析之间存在高度对应关系。接下来，作者应用了一个主成分分析（PCA），它考虑了描述TF绑定特性的几个指标（图2f）。这一分析揭示了两个关键特征。首先，拓荒者TFs在RAS-OIS诱导（即预刺激）之前沿着基因组进行静态、广泛和最重要的结合，而定居者和迁移者TFs在RAS-OIS诱导之前更动态地结合（图2f），更不频繁（图2f），平均来说在OIS诱导沿着基因组。其次，AP-1 TFs在其他先锋TFs（图2f中黑圈突出显示）中明显突出，因为它们在RAS-OIS诱导前与增强子发生特异性和广泛性结合，而其余的先锋TFs大多倾向于远离它们而累积。总之，作者确定增强子激活和AP-1是在衰老过程中开创和形成转录允许的增强子景观的关键因素。

AP-1先驱TF标记增强子预示着衰老转录程序

图3 | AP-1衰老促进剂景观的先锋tF书签预示着衰老转录程序

鉴于作者发现大部分增强子的激活都是在未标记染色质区域外发生的，作者探讨了AP-1作为未来和过去增强子活动的通用标记剂的作用。增强子标记动力学的量化（图3a）揭示了对于从T0的“未标记”状态转变为72小时或144小时的“活动增强子”状态（H3K4me1 H3K27ac）的窗口，H3K4me1和H3K27ac水平从初始水平（T0）类似于稳态未标记区域，但不同于平衡增强剂，到最终水平（144小时）无法与本构增强剂区分（图3a）。相比之下，对于从T0的“活动增强”状态转换到72小时或144小时的未标记状态（作者称之为“残余增强”）的窗口，H3K4me1和H3K27ac水平都在逐渐下降，从最初的不可区分的组成性增强剂水平下降到最终水平，类似于未标记区域，不同于平衡增强剂（图3a）。平均而言，每一类增强子的动态行为与邻近基因的表达谱相关。

为了显示defi-novo增强剂的功能作用，作者使用CRISPR干扰（CRISPRi）。以DCAS9Krab转录抑制因子为靶点的四种不同的导向RNA（GRNA）在IL1A（编码白细胞介素-1α和IL1β基因座显著降低了癌基因RAS诱导后8或14天分析的IL1B和IL1A的表达，除了IL1B启动子附近的两个gRNAs诱导的IL1A表达轻微降低（图3b）。作为对照，靶向IL1A/IL1B基因座下游区域的gRNA（g54）对两种表达都没有影响，两种definovo增强子之间的gRNAs（g2和g48）靶向序列有中度影响。作者接下来确定TFs书签是否定义了未来激活的增强子，以及TFs书签是否作为分子记忆的一部分在其失活后对残余增强子进行了增强子。事实上，作者发现AP-1是主要的TF书签定义和残余增强剂（图3c）。由于CRISPRi可以控制两个核小体长度（~300bp）的抑制，因此g7很可能也影响了这个AP-1结合位点。此外，靶向非增强子AP-1位点的对照gRNA（g2）不影响IL1的表达，这表明只有位于AP-1位点的增强子起作用。最后，对接受RS的细胞中AP-1 TFs的定位进行检查，验证了它们对definovo和残余增强剂书签的重要性。作者注意到3334种definovo增强剂中只有2480种被TF标记，其余的（n=854）没有任何可检测到的TF结合活性（图3d）。因此，defi novo增强子可进一步分为两个亚类，从而扩展衰老增强子的范围：（1）TF书签definovo增强子和（2）TF virgin definovo增强子，它们使人想起先前描述的潜在增强子。总之，作者的研究结果提供了证据，表明definovo和rementenhancers在确保促衰老基因在正确的时间和水平上表达方面发挥了关键作用，并强调了AP-1书签对于表观遗传记忆过去和未来enhancer活动以定义衰老的重要性成绩单。

一个分级的TF网络定义了衰老转录程序

图6 |分级tF网络定义衰老转录程序。

目前，还没有一个调节衰老的TF网络，这就排除了对衰老表型的有意治疗操作。为了阐明TFs与增强子的组合和动态结合以及它们在TF网络中的组织，作者首先计算了在进行RAS-OIS、RAF-OIS或RS的WI-38成纤维细胞中增强子共现的TFs对（图4a-c）。此外，以启动子为中心的词典52包含许多E2F-TFs，这与E2F在启动子中的主要作用是一致的。接下来，作者基于作者的时间TF共结合信息和先前发布的TF网络策略开发了一个算法，以可视化衰老TF网络的层次结构。在图6a中，作者展示了SASP基因模块VI的TF网络的一个代表性例子，它具有三层结构：（1）由先锋TFs的AP-1家族专门定义的顶层，（2）主要由其他先锋和定居者TFs组成的核心层，（3）以定居者和定居者为特征的底层移民TFs。核心层本身根据到顶层和底层TF连接的复杂性分为多级和单层核心层（图6a）。尽管核心层和底层的TF多样性很高，但TF网络的组织逻辑对于所有基因表达模块来说都非常相似。RAS-OIS的TF网络拓扑结构与网络每一层中每个TF类别（即先驱、定居者或移民）的生化和动力学性质一致。当交互从上到下流动时，TFs的动态性和数量增加，绑定区域的数量减少。对每个网络中所有TFs的动态性指数和绑定区域的数量进行排名，证实了它们组织的层次性原则，在所有网络中共享来自顶层的高度连接TFs的公共核心和核心层。

图7 |层次关系：AP-1先锋tF的功能紊乱，但没有其他tF，逆转衰老时钟。

作者的结论是，衰老反应是由一个通用的三层TF网络结构编码的，并且强烈依赖于AP-1先锋TFs实现的增强景观的开发，通过与定居者和移民TFs的局部、多样和动态交互来编排OIS转录程序。层次问题：AP-1先驱TF的功能紊乱，但没有其他TF，逆转衰老时钟。先锋TFs代表了操纵细胞命运的有吸引力的靶点，用于不同的研究和治疗目的。因此，在癌基因RAS表达后的T0、72和144小时，作者使用每个TF的两个独立sia耗尽了先驱TF cJUN和定居者TFs ETS1和RELA，然后将全局基因表达谱与对照组处理的细胞进行比较（图7a-Cc）。使用PCA捕捉它们的转录轨迹（图7a）说明了ETS1和RELA在任何给定时间点沿着第二主成分（PC2，捕捉siRNA相关变异性）的功能性扰动轨迹与控制时间过程相比发生了变化。然而，它并没有影响RAS-OIS基因表达程序的及时执行，因为第一主成分（PC1，捕捉时间相关的变异性）没有变化。相反，在RAS-OIS诱导后72h，干扰cJUN功能可使PC1和PC2的轨迹发生改变，并有效地将RAS-OIS转录轨迹恢复到与对照组成纤维细胞密切相关的水平。72小时沉默cJUN表达也使T0时的转录谱更接近于对照处理细胞（图7a，蓝色箭头）。对每个TF的靶基因（直接和/或间接）的功能过度表征分析进一步支持了siRNA-cJUN介导的RAS-OIS转录轨迹的逆转，这表明cJUN的缺失导致炎症反应的抑制（即，SASP）和促增殖基因（即E2F、G2M和有丝分裂纺锤体靶点）的部分再激活（图7b）。为了量化和可视化siRNA-cJUN处理和siControl处理细胞间差异表达基因的时间重叠，作者使用了一个翻转图和表达热图（图7c）。与衰老时钟的重置一致，大量促增殖E2F靶基因（16.5%；例如，CCNB2和CDCA8）被上调（扩展数据图9a），NF-ÊB调节的SASP靶基因（例如，IL1B和IL6）在cJUN基因敲除后下调（37.5%）。cJUN基因敲除导致p53靶基因亚群（37.5%）失调，提示AP-1与p53之间存在功能性相互作用。cJUN缺失的RAS-OIS细胞也具有Notch-1-细胞内域诱导衰老转录特征32的基因子集（21.3%）的相似表达谱。总之，这些数据表明AP-1是衰老的主要调节因子和分子“时间守护者”。

AP-1在TIS中的作用

图8:AP-1在tIS中的功能作用。

为了扩展AP-1作为RAS-OIS衰老相关基因表达程序的先驱和主调节因子的发现，作者研究了AP-1在体外和体内化疗诱导的衰老（即TIS）中是否也起决定性作用。因此，作者首先通过治疗两个结直肠癌（CRC）细胞系HCT116和SW480，过度表达一种不可磷酸化的显性阴性亚型cJUN（cJUN4A）或使用化疗药物阿霉素（ADR）进行空载体控制来诱导TIS。cJUN4A的表达对衰老诱导率没有明显影响（图8a，b）。然而，它显著抑制了TIS诱导的cJUN在两种CRC细胞系中的转录上调，这与cJUN驱动其表达的作用是一致的。接下来，作者测量了所选的AP-1依赖性SASP、干细胞相关、凋亡相关和E2F靶基因的表达（图6b）。该分析显示，与空载体、对照细胞（图8c、d）相比，表达的cJUN4A中的SASP、stemness（例如，LIF、ABCG2和CD44）和抗凋亡（例如，BCL2A1）靶基因显著抑制。值得注意的是，E2F靶基因（如CCNB2和CDCA8）在表达大肠癌细胞系的cJUN4A（图8c，d），这表明与作者在成纤维细胞RAS-OIS中的发现相比，存在细胞类型依赖性差异。为了将作者的发现扩展到不同来源的原发性肿瘤，作者评估了AP-1在已建立的B细胞淋巴瘤的EÌmyc转基因小鼠模型中的作用。与大肠癌细胞株的结果一致，cJun4A在原发性小鼠B细胞淋巴瘤中的过度表达（稳定表达Bcl2以阻止凋亡）并不影响ADR治疗后的TIS建立（图8e）。相反，它积极地抑制了AP-1靶基因，与作者在接受ADR-TIS的大肠癌细胞系中观察到的相似（图8f）。接下来，作者探讨了AP-1依赖性衰老在体内抗癌治疗后长期预后中的作用。为此，作者使用AP-1衰老基因表达特征进行了基因集富集分析（GSEA），首先在体内暴露于环磷酰胺（CTX）的小鼠队列中进行了基于原发性EÌmyc淋巴瘤的临床试验。AP-1衰老基因表达特征在淋巴瘤的诊断（即在任何药物接触之前）中显著丰富，这些淋巴瘤最初对CTX治疗有反应，但最终复发（称为“易复发”（RP）），这使它们明显区别于同一组淋巴瘤，随后表现为对反复使用CTX（称为“耐药”（RES））的完全耐药（图8g）。然后，作者研究了这种AP-1衰老基因表达特征的人源化版本是否会在人类弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）材料中富集，这些材料是在诊断患者获得持久肿瘤控制（无肿瘤）时获得的，以响应R-CHOP（CD20特异性抗体）的标准护理诱导治疗利妥昔单抗加CTX、ADR、长春新碱和强的松）。值得注意的是，两个公开的独立数据集（GSE31312和GSE98588），包括诊断时的淋巴瘤转录体数据和DLBCL患者的临床病程，显示了与复发患者相比，长期无瘤DLBCL患者AP-1衰老基因特征的高度显著丰富在R-CHOP治疗后（图8h，i）。总之，作者的数据强调AP-1调控衰老相关基因表达程序的生理重要性，并强调其对体内抗癌治疗后长期结果的贡献。
本研究强调了整合时间分辨全基因组图谱来描述和询问衰老细胞命运的优势，为老年性疾病和癌症的衰老状态诊断和调控提供了新的思路。

原文链接：https://doi.org/10.1038/s41556-020-0529-5

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