中华蜜蜂 Apis cerana cerana ( 简称中蜂) 是我国特有的蜂种，对我国养蜂业、农业以及生态平衡均有着至关重要的作用 ( 余林生，2007; 杨冠煌，2009) 。蜂王作为蜂群中唯一具有完整生殖能力的个体，其质量的好坏对蜂群的影响尤为重要。优质的蜂王产卵力强可以使蜂群维持较强的群势，所产的后代也会表现出较强的生活力及抗病能力( 匡邦郁，2003) 。在中蜂养殖过程中由于蜂王衰老会导致产卵力等一系列机能下降，因此需要每年更换蜂王，以保证蜂群维持较强的群势，提高蜂产品的产量 ( 刘仰文，1966) 。因此，人工培育优质蜂王对中蜂的饲养管理十分重要。
到目前为止，人工育王已有大量的研究，并取得了一定的研究成果，其中包括单式移虫以及复式移 虫 ( Doolittle，1888; 陈 世 壁，1989 ) 。但由于在移虫或移卵过程中稍有不慎便会对卵或幼虫造成伤害而影响蜂王质量，为了减少对幼虫的伤害，江西农业大学蜜蜂研究所团队研制出了免移虫育王生产器，并已在意大利蜜蜂 Apis melliferaligustica ( 简称 意 蜂) 应 用，取得了良好的效果( 刘 光 楠 等，2011; 张 飞 等，2013; Pan et al. ，2013) 。与人工移虫育王相比，免移虫育王简单快捷且对幼虫不会造成机械损伤。在此基础上，根据中蜂的生物学特性研制了中华蜜蜂的免移虫育王生产器。邹垂彬等 ( 2016a) 对中蜂的免移虫育王和人工移虫育王进行了比较，发现两种方法培育的蜂王在初生重、胸重和卵巢管数量方面均无差异，但免移虫育王培育的蜂王腹部卵黄蛋白原基因 ( Vitellogenin，Vg) 表达量更高。
排除季节与环境等因素，王台在蜂群中所处位置不同也会对蜂王的质量有所影响 ( Al-Fattahet al. ，2011) 。基于中华蜜蜂特殊的保温和散热机理以及边脾充足的贮蜜贮粉等特点，张 建 国 等( 2006) 研究发现边二脾易于控制最佳繁殖温度，更适合蜂王的生长发育和适龄工蜂的泌浆喂饲及看护，是培育蜂王的最佳位置。王瑞生等 ( 2013)在春秋分蜂热期间观察了自然王台出现的位置，并统计卵虫脾、封盖子脾以及蜜粉脾上出现王台的概率，发现王台出现在封盖子脾上的概率显著高于其他两组，且蜜粉脾出现的概率仅有 8. 57% 。在人工育王时为了让王台内的幼虫得到更充分地哺育，通常将育王框置于蜂箱中间位置的子脾之间。但不同的子脾类型 ( 封盖子、未封盖幼虫或卵) 对蜂王的质量是否有影响，目前尚无相关报道。因此，本研究采用免移虫育王方法进行育王，将育王框分别置于两张封盖子脾之间、两张幼虫脾 ( 未封盖幼虫) 之间以及两张混合脾 ( 巢脾上同时有封盖子和未封盖幼虫，比例约为 1 ∶ 1) 之间，探究育王框在不同类型的子脾间对出房蜂王质量的影响，为优质蜂王的培育奠定基础。
1. 1 试验材料1. 1. 1 试验蜂群
试验所需中华蜜蜂饲养在江西农业大学蜜蜂研究所，所有蜂群采用郎氏标准蜂箱饲养; 选取蜂王年龄、蜂群群势 ( 5 足框) 和蜂群遗传性状基本一致的 5 群蜂作为试验蜂群; 取 1 群母本群专职产卵，3 群哺育群用于育王，1 群备用。
1. 1. 2 主要仪器设备
中蜂免移虫育王器，育王框，王笼，手术用眼科剪刀，镀烙游标卡尺 ( 十分度) ，立体解剖显微镜，电子天平 ( MINQIAO，JN3103N) ，恒温恒湿培养箱 ( BINDEＲ) ，实时定量 PCＲ 仪 ( AppliedBiosystems，7500 ) ，离 心 机 ( Anke，TGL-16B ) ，PCＲ 仪 ( Eppendorf，Mastercycler) ，小型台式冷冻离心机 ( Eppendorf，Centrifuge 5424Ｒ) 。
1. 1. 3 试验试剂
0. 9% 生理盐水，DEPC 水，75% 乙醇，Trizol试剂，氯 仿 及 异 丙 醇，引 物、灭 菌 水、ＲOX 和SYBＲ GＲEEN Ⅱ ( Takara 试 剂 公 司 提 供) ; 其 中DEPC 水、Trizol 试剂、氯仿及异丙醇均置于棕色试剂瓶中遮光保存。
1. 2 试验方法
1. 2. 1 蜂王的培育
1. 2. 1. 1 免移虫育王器的准备
免移虫育王器为江西农业大学蜜蜂研究所研制的中华蜜蜂仿生免移虫育王生产器 ( 邹垂彬等，2016b) ，包括塑料巢础、托虫器、王台、育王框等 ( 图 1) 。
1. 2. 1. 2 1 日龄幼虫的获取
将蜂王控于塑料巢脾上产卵 6 h 后放出，3 d后直接将托虫器取出并安装于无底王台中，将育王框放入哺育蜂群中。
1. 2. 1. 3 哺育群准备
育王时应提前 8 h 移走哺育群的蜂王，并防止蜂群改造急造王台和工蜂产卵。随时调整各哺育群确保蜂群有两张封盖子脾 ( 或幼虫脾或混合脾)( 各目的巢脾分别位于边二脾和边三脾) ，同时保持群势基本一致，重复试验 3 次 ( 移虫后将育王框分别放于两目的巢脾之间) 。
1. 2. 1. 4 王台接受率
移虫前一天将准备好的王台放入蜂群中清理，然后将带有 1 日龄幼虫的托虫器与塑料王台组装好固定于育王框上，分别置于蜂群的两张封盖子脾 ( 或幼虫脾或混合脾) 之间培育蜂王，2 d 后检查记录王台接受情况 ( 王台加高且周围有许多哺育蜂表示接受) ，计算王台接受率。
1. 2. 2 蜂王个体指标测定
初生重: 蜂王出房后立刻用电子天平称重，记录数据;
胸重: 用小手术剪取出蜂王胸部，去 除 足、翅，用电子天平称重记录数据;
测量胸宽: 用游标卡尺测量上述蜂王胸部宽度。
1. 2. 3 卵巢管计数
参考许少玉等 ( 1984) 的蜂王卵巢管解剖和简便记数法进行蜂王卵巢的解剖，取卵巢中段平行横切 3、4 段，选取一段置于干净的载玻片上面进行染色，在解剖镜下用昆虫针轻轻地将卵巢小管逐条剥离并计数，即可得到每个卵巢的卵巢小管数，记录数据。
1. 2. 4 蜂王卵巢卵黄原蛋白基因 ( Vg) 测定
初生蜂王活体解剖取出蜂王卵巢进行 ＲNA 提取和 cDNA 合成，提取 ＲNA 和 cDNA 合成方法参考秦秋红 ( 2013) 。Loureno ( 2008) 研究指出 βactin 在蜜蜂中表达十分稳定，本研究以 β-actin 基因作为内参基因，卵黄原蛋白基因 ( Vg) 引物引用廖春华等 ( 2016) 的引物，由上海生工生物有限公司 合 成 ( 表 1 ) 。荧 光 定 量 PCＲ 反 应 体 系( 10 μL) : cDNA 1 μL，SYBＲ GＲEENⅡ 5 μL，上游和 下 游 引 物 各 0. 4 μL，超 纯 灭 菌 水 3. 0 μL，ＲOX 校正液 0. 2 μL; 各成分混匀加入 0. 2 mL 荧光定量专用 8 连 PCＲ 管 ( BBI Life sciences 公司提供) 。荧光定量 PCＲ 反应条件: 95℃ 预变性 30 s;95℃，10 s，58. 9℃，1 min 40 个 PCＲ 循环。扩增反应结束后从 55℃匀速加热 ( 每 6 s 升高 1℃ ) 至95℃，建立熔解曲线。每个生物学样本设置 5 个技术重复，计算各个目的基因的相对表达水平。
1. 2. 5 数据统计与分析
王台接受率和蜂王个体外部指标试验数据利用 StatView 软件进行方差分析; 蜂王卵巢 Vg 基因相对表达水平用 Livak 和 Schmittgen ( 2001) 建立的 2 － ΔΔCt法计算后利用 StatView 软件进行方差分析与 t 检验，当 P ＜ 0. 05 时认为差异显著。
2. 1 育王框位置对王台接受率的影响
将育王框置于封盖子脾之间、幼虫脾之间、混合 脾 之 间 的 3 个试验组幼虫接受率分别为63. 61% 、75. 69% 以及 68. 75% ，其中育王框置于幼虫脾之间时幼虫接受率显著高于封盖子脾组( P ＜ 0. 05) ，而幼虫脾组与混合脾组以及封盖子脾组与混合脾组幼虫接受率并无显著差异 ( 表 2) 。
2. 2 育王框位置对蜂王个体指标的影响
封盖子 脾 之 间、幼虫脾之间和混合脾之间3 个试验组在蜂王初生重、胸重、胸宽和卵巢管数等指标均差异不显著 ( P ＞ 0. 05) 。不同类型子脾间培育的蜂王在外部指标上并无显著差异 ( 表 3) 。
2. 3 育王框位置对蜂王卵巢 Vg 表达量的影响
以混合脾作为对照组，3 个试验组蜂王卵巢Vg 相对表达量如图 2 所示，其中幼虫脾蜂王卵巢卵 Vg 表达量显著高于封盖子脾组 ( P ＜ 0. 05) ，而幼虫脾组和混合脾组以及封盖子脾组与混合脾组幼虫接受率并无显著差异。
蜂王的发育受很多因素的影响，移虫育王时幼虫日龄的选择尤为重要，日龄大小对蜂王的初生重、卵巢管数量、交尾的雄蜂数量和贮精囊内的精子数量等都有直接的影响 ( Dedej et al. ，1998; Tarpy et al. ，2011) 。人工育王时随着移取幼虫日龄的增加培育出的蜂王初生重、卵巢管数、储精囊大小及储精囊中精子数等各项指标均呈下降趋势，即幼虫日龄越小培育出的蜂王质量越优( Woyke，1971; 樊莹等，2013; 庞倩等，2017a) 。不同日龄幼虫培育的蜂王在基因表达和蛋白质组方面也存在显著差 异 ( Pang et al. ，2017; 庞 倩等，2017b) 。本研究采用免移虫育王技术进行人工育王，待卵孵化成幼虫 ( 即 1 日龄幼虫) 时置于王台条上，转移至哺育群中，这样既保证了幼虫为 1 日龄，又不会损伤幼虫。
人工育王时王台在育王框中的位置和王台的数量均对蜂王的质量产生影响，育王框中部和下部的王台培育的蜂王质量较好，育王时王台数量过多会使出房蜂王的质量下降 ( Al － Fattah et al. ，2011) 。育王框置于幼虫脾之间时，王台的接受率显著偏高 ( P ＜ 0. 05) ，这可能是由于幼虫脾上大量的幼虫需要大量的哺育蜂，使得邻近的王台也得到了更多哺育的机会，从而提高了王台接受率( Huang，1991) 。蜂王的初生重与蜂王质量正相关，并随季节呈现明显的变化趋势，与外界温度、蜜粉源和蜂群群势等存在着密切的相关性 ( 谢代癸，1983; 毕建璐和李志勇，2003) 。本研究中育王框置于封盖子脾、幼虫脾和混合脾之间培育的蜂王初生重、胸重、胸宽和卵巢管数等指标差异不显著 ( P ＞ 0. 05) 。
Vg 是一种多效性基因，为蜂王卵巢的发育提供营养和功能性物质。Vg 基因的表达水平对蜂王的免疫力、寿命、卵巢发育以及生殖能力均有影响 ( Engels，1974; Amdam et al. ，2005; 张卫星等，2014; 李 志 勇， 2016 ) 。 Koywiwattrakul 等( 2009) 研究发现无王群中工蜂卵巢发育后 Vg 的表达量是卵巢未发育工蜂的的 4 倍，是有王群中卵巢未发育工蜂的12 倍。因此 Vg 的表达量可以用来衡量雌蜂的卵巢活化程度。幼虫脾之间出房的蜂王卵巢 Vg 表达量显著高于封盖子脾之间出房的蜂王卵巢 Vg 表达量，这说明幼虫脾之间的位置培育的蜂王卵巢激活程度相对更高，但具体机理尚不清楚。不同位置培育的蜂王在交尾后的产卵力、寿命和免疫力方面是否表现更为优越还有待于进一步研究。
综上所述，育王框置于不同类型子脾之间培育的蜂王在个体指标方面没有明显差异，但是王台接受率和 Vg 表达量均是幼虫脾之间最高。因此，在人工育王过程中应尽可能将育王框置于未封盖的幼虫脾之间，以提高王台接受率和蜂王卵巢活化程度。
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